美国Biolife品牌CryoStor临床级即用型冻存液产品都预先配制了USP级DMSO，这是一种渗透性冷冻保护剂，有助于减轻冰的形成造成的损害。在各细胞类型中，CryoStor配方已被证明相比商业和家庭酿造的等渗和细胞外配方，更能有效地减少保存后的凋亡和坏死。CryoStor产品符合 USP <71> 无菌和 USP <85>内毒素检测标准，并按cGMP生产。

CryoStor CS10预先配制了10%的DMSO，在冷冻、储存和解冻过程中为需要10% DMSO的细胞和组织提供了安全、保护的环境。通过调节对低温保存过程的分子生物学反应，CryoStor提供了增强的细胞活力和功能，同时消除了血清、蛋白质或高水平的细胞毒性制剂的需求。

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产品特点

•  单独的Biolife品牌标签

•  预配置（10%DMSO）

•  无血清

•  无蛋白

•  USP级别/高质量组分

•  cGMP制造 

•  FDA药物主文件备案

•  无菌、内毒素,以及细胞放行测试

产品规格

产品参数

Jurkat T细胞微球悬浮在指定的低温培养基中，然后放置在2 ml 冻存管中，并在2-8℃下孵育15分钟。然后将cryovials转移到无LN2-程序降温仪以-1℃/分钟的速度冷冻保存。在达到-70℃后，将样品转移到LN2储存至少24小时。样品在指定条件下解冻，用CGM(1:10稀释)重悬，在37℃和5% CO2下转移到培养箱。在NucleoCounter NC-3000成像细胞仪(ChemoMetec，丹麦)上使用Via-1盒，根据膜完整性评估立即和解冻后24小时内的细胞存活率和计数。

图1-Jurkat T细胞的活力是基于在解冻后24小时内使用膜完整性测定进行评估。

图2-使用膜完整性试验评估了解冻后Jurkat T细胞的可见复苏率和扩增性能。

结论

1、解冻后立即对细胞活率和数量进行分析并不能反映冷冻保存过程成功与否。未优化的冷冻培养基的不良影响可能需等待解冻后的24-48小时才能检测到，这归因于低温保存诱导的延迟性细胞死亡(DOCD)。另一方面，优化的低温保存介质的加入可以防止DOCD的发生；因此减少了变异性，更准确地估计了解冻后的生存和增殖。

2、低温贮藏前的补料时间和培养基的变化对低温贮藏过程的结果有重要影响。这可能是由于一些参数，包括在冷冻前活力试验中没有出现的压力积累，但与DOCS结合，导致解冻后活力和功能的较大损失。

3、冰成核的随机性本质上导致了细胞在低温保存过程中所承受的低温保存诱导应力的变化。因此适当的成核对模型T细胞的生存能力和增殖能力有较大影响。

4、在37°C介质中稀释(类似于患者给药情景)是解冻后的更佳稀释实践。为了分析目的，建议细胞应在温暖介质中稀释，以尽量减少在洗涤过程中渗透细胞的肿胀和溶解。

1、将待冷冻保存的细胞重悬置于悬浮液中（机械或酶法解离）

2、对细胞进行离心

3、去除上清液（注意:尽可能多地去除培养基，以减少冷冻液的稀释。）

4、添加冷(2°-8°C) 的cryostor冻存液。细胞浓度按照常规细胞培养方案0.5-10*106细胞/mL(可能更高)。DMSO是预先混合在cryostor冻存液中且冻存液中不含添加剂。

5、预冷冻：细胞悬液在2°-8°C下孵育约10分钟。

6、冷冻成核：在-80°C冷冻样品(许多protocol推荐交替使用-70°C和-80°C环境来处理样本)。对大多数哺乳动物细胞系统推荐使用程序降温仪来控制速率冷冻(-1°C/min)，如果使用冷冻装置或异丙醇容器则应提前容器预冷至2°-8°c，使用异丙醇容器的冷冻时间(-80°C)建议约为4小时，或不超过一夜。样品内的冰成核应在大约-5°C下开始，使用可控速率冷冻机上的液氮爆裂程序设置，或在大约15-20分钟后对冷冻液/样品容器进行机械搅拌(轻弹或轻敲)。

7、储存：将样品放入储存室，在液氮温度下(低于-130°C)储存样品。样品储存在-80°C仅建议短期储存(数周至数月)。

8、解冻：在37°C水浴或同类似的机械解冻装置中快速解冻样品，样品融化时应轻轻地旋转样品，直到所有可见的冰都融化。在冰冻箱中，1ml样品的大约解冻时间为2-3分钟。不允许样品在冷冻温度(0-10°C)以上加热。冷冻瓶从浴液中取出时，摸起来应该是凉的。不建议被动解冻。

9、立即用培养基或等效等渗介质稀释细胞/冷冻液混合物。稀释程序可以在一个步骤中完成。稀释介质应在20°C至37°C之间。建议稀释比为1:10(样品与介质)或更大。

10、应用合适的配置下种细胞。

11、将细胞放入培养条件或立即使用。

12、解冻后进行24小时生存能力评估。

注:为了获得低温保存后细胞活力的准确测量，应在解冻后24小时进行评估，并与非冷冻对照样本进行比较。样品解冻后立即使用膜完整性指标(如台盼蓝)进行评估，以比较分析样品细胞产量和存活率，这往往导致对细胞存活率的测量不准确。建议采用活/死荧光分析或代谢分析(MTT或alamarBlue*)更准确地评估可行回收率。

CryoStor产品在环境温度下运输。收到后，请保存在2-8°C，避光，直至准备使用。

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