发布时间：2024/05/10 点击数：冷冻保存的主要目标是在较长时间内保持活细胞的活力和功能。通过仔细冷冻细胞并防止冰晶的形成来减少低温诱导的细胞损伤，在深低温的条件下，使细胞内的代谢活动处于静止状态从而确保细胞可以长时间储存而不会影响其完整性。对细胞进行复苏，使活力和功能得以恢复，并用于后续研究或临床用途，如细胞治疗中的冷冻制剂产品。
低温保存(和解冻)优化中，每个步骤细节都有可能成为风险点和潜在优化点，即题主所说的注意事项。下面答主将从对细胞冷冻过程的理解着手，帮助大家理解并优化冻存实验。
冷冻过程中的物理和生物化学变化见下图。冷冻过程从将溶液冷却到冰点以下开始。一旦第一个冰核在零度以下的温度下形成，冰晶就会生长，直到它们与剩余的未冻结部分达到平衡。当纯水形成冰晶时，未冻结的部分现在含有更高的盐浓度和更低的冰点。细胞留在未冷冻部分的通道中。
随着温度的降低而继续冻结，更多的水以冰的形式从溶液中凝固出来，导致盐度增加，溶质毒性增加，剩余未冻结部分的冻结温度越来越低。
随着温度下降，未冷冻部分的细胞暴露于盐度增加(和溶质毒性)的环境中。在低于-20°C的温度范围内，未冻结部分的盐度可能高达常温初始盐度的10-20倍。回想一下，细胞膜在较低的温度下变得更具有渗透性。这种增加的盐度和溶质毒性影响了冷冻期间的细胞内环境。
因此，由于物理效应(冰形成)和生化效应(盐度、溶质毒性、蛋白质结构损伤、细胞内信号等)引起的冷冻相关应力的大小也不容忽视。此外，细胞对增加的细胞外溶质浓度的渗透反应由水的流出而缩小。对这些机械和生化变化敏感的细胞在冷冻过程中更有可能经历细胞损伤和细胞死亡，包括当冷冻持续到细胞-溶液混合物的玻璃化转变温度(Tg)时，然后在适当的条件下玻璃化成玻璃态。
现在考虑一下，在制造细胞类型产品的过程中，细胞是如何受到这种冷冻过程的影响的:缓慢的冷冻速度将使细胞对细胞外环境不断增加的渗透压作出渗透反应，从而失去水分并缩小尺寸。这一过程减少了细胞内结冰的可能性-这是在冷冻保存过程中造成细胞损伤无法修复的主要因素。
由于低温和细胞环境的作用，渗透收缩是一个动态过程。因此，快速的冻结速率可能没有足够的时间让细胞脱水足够的水，因此增加了细胞内冰形成的可能性。细胞内冰的生长可以物理地破坏膜。
在快速冷冻速率的情况下，如果冰量过多，细胞可能被裂解，或者即使细胞内冰量较少，细胞也可能被破坏到无法修复的程度。一般来说，冷冻速率约为-1°C/ min左右，可以使水膜动力学使CGT相关细胞类型脱水，从而减少细胞内冰的形成。
为了减少渗透收缩，以及由于溶质浓度增加而产生的毒性，在溶液中加入冷冻保护剂(CPA)(膜渗透和/或非渗透)。研究较多的冷冻保护剂之一是二甲基亚砜，或称DMSO。
有效的冻存可以更大限度地保持细胞活力和遗传稳定性,减少细胞损伤，过程步骤包括选择合适的低温/低温生物保存液和冷冻保护剂，培养基添加速率，培养基添加温度，冰成核温度，冷却速率，储存温度，升温速率，以及储存介质和冷冻保护剂的去除或稀释。仔细考虑这些步骤可以大大提高生物保存的效果。
1. 细胞的生长状态：
在冻存之前，确保细胞处于良好的生长状态，生长旺盛期或对数生长期细胞的生存率通常更高。
2. 冻存介质的选择选择（及冷冻保护剂CPA的浓度）：
不同冻存液介质对细胞的保护机制和效果不尽相同，为确保冻存介质的质量选择合适的冻存介质非常关键。
冷冻介质的传统方法是配制自制的冷冻保护剂(如DMSO或甘油)与血清(人或动物)或蛋白质(白蛋白)的混合物。这些将被添加到等渗(细胞外样)载体溶液中，如培养基或盐样溶液，这些溶液不是为低温生物保存而设计的，而是为恒温离子条件而设计的。
相比之下，另一种冷冻保存方法是利用无血清和无蛋白的细胞内样配方设计，如BioLife Solutions品牌的冻存液，致力于解决细胞在低温下的离子平衡,渗透压和氧化应激等,这种较新的方法已被纳入许多发展中的CGT，包括已获得的CGT监管许可和上市许可。
3. 冻存细胞的密度：
细胞密度不宜过高，以免冻存后造成细胞间互相影响。针对不同细胞类型和预期目标，需要测试对应的冻存密度范围，配合其他步骤以优化获得更佳的冻存和复苏活力。如PBMC，4-20e6个细胞/mL；MSC为1e6个细胞/mL左右。
4. 冷冻保护剂添加速率：
缓慢冷却可以减少冰晶的形成，保护细胞结构。
5. 冷冻保护剂添加温度：
与CPA添加速率相关的考虑类似，一些protocol规定了冷冻介质的应用温度。温度的选择可能与促进CPA更快的渗透有关，也可能与降低CPA的潜在毒性有关。
6. 冷却速度：
大多数CGT细胞产品可能会发现大约-1°C/min的冷却/冷冻速率(平均或集中在成核周围的初始阶段)是足够的，如果不是更佳的，建议（并且通常期望）验证并优化每个类型细胞产品的冷冻速率，作为循证生物保存的更佳实践。
7. 储存温度：
低温保存的CGT产品通常储存在液氮(LN2)中，以实现低于其玻璃化转变(Tg)温度的超低低温，并实现多年的稳定性。另外，可能需要进一步考虑在-80°C温度范围内的短期稳定性(数周至数月)。冻存过程中应尽量避免温度波动。
8. 升温/解冻速度：
避免复苏过程中冰晶再次形成造成细胞损伤。
9. 解冻后清洗、稀释或直接使用：
关于冷冻保存介质解冻后的状态有各种各样的方法，冷冻保护剂是否去除，可参考对应的冻存介质的使用说明。
10. 数据记录和监控：
详细记录冻存和复苏的数据，以及任何观察到的异常情况，必要时进行质量控制检查。
11. 其他细节：
包括详细标记冻存管，包括细胞种类、冻存日期、冻存代数、操作者姓名等信息，以确保冻存细胞的识别和追踪；冻存与复苏的标准化：制定标准操作流程（SOP），确保每个步骤的一致性和可重复性。
根据这些冻存原则和步骤进行时间和优化，以更大程度地保持细胞的状态，提高复苏后细胞的活力和功能恢复，为后续应用奠定坚实的基础。
