1   研究摘要

细胞疗法已被临床验证为有效的治疗模式，并有可能改变医学发展。在GMP级冻存液中低温保存及在液氮(LN2)中储存和运输是细胞治疗优先选择的商业化方法，但储存在LN2细胞库中的常规样品入口可能使相邻细胞制剂受到温度漂移的影响，从而可能对冷冻细胞的稳定性产生负面影响。

本研究的目的是评估两种常用的冷冻保存介质和重复TWE对临床相关的间充质干细胞/基质细胞(MSCs)的影响，并确定基于验证的更佳生物保存实践是如何改善细胞冻存效果的。

2   研究方法

细胞培养

将无外源的人间充质干细胞(hMSCs) (RoosterVial-hBM-20M-XF)培养在Rooster Basal -MSC培养基中，并在培养室中添加Booster-MSC-XF。

低温保存

将不含外源物质的人间充质干细胞(Rooster Bio, Frederick, MD) （1x106个细胞/ml）冷冻保存在传统的自制MSC冷冻培养基中(HB;5%人血清白蛋白/10% DMSO/Plasma-Lyte A)或GMP生产的CryoStor CS5冻存介质(CS5;BioLife Solutions, Bothell, WA)。

将悬浮在低温介质中的hMSCs置于1.2 mL Fluid X冷冻瓶中，在2-8℃下冷却10分钟。冷冻瓶使用异丙醇冷冻装置或渐进线控制速率冷冻器以-10℃/min的速度冷却至-10℃，手动成核，然后冷冻至-80℃。然后将冷冻瓶转移到LN2储存至少24小时。

运输和储存

为了模拟临床条件，冷冻保存的样品用evo DV-4 LN2智能托运设备(Savsu Technologies, Albuquerque, NM)运送到Brooks Life Sciences (Chelmsford, MA)。收到样品后，将样品分为不同实验条件下的单独冷冻箱，并保存在LN2冷冻库(BioStore III型自动冷冻机)中。

短暂变暖事件（TWE）

hMSC对照组保持在LN2冷冻室内，而TWE则通过将低温容器暂时暴露于环境中0、5、10、15和20次循环来启动。在每个TWE循环中，低温瓶暴露在温度约为-110℃的环境中，然后返回LN2冷冻室。将样品加热到-110℃的TWE时间约为10分钟。在开始后续的TWE之前，允许低温瓶返回到-180℃以下。

活力、恢复与功能评估

将样品送到RoosterBio和BioLife，在立即解冻后和解冻培养后进行活力与恢复、扩增、IDO分泌和代谢活性的测定。

3   研究结果

01   储存过程中的短暂变暖事件不会损害hMSC的长期功能

图1：储存过程中的短暂变暖事件不会损害hMSC的长期功能

MSCs在传统“自制”冷冻介质(HB)或预先配制含有5% DMSO (CS5)的GMP制造的CryoStor冻存液中以1x106个细胞/ml密度冻存，解冻后表现出相似的细胞活力，不受重复短暂升温事件(TWE)的影响。解冻后，将hMSCs (P3)洗净，在添加了Booster的RoosterBio基础培养基中以3000个细胞/cm2的速度接种，培养5天至P4，并评估其功能，结果如图1所示。

无论使用何种低温介质或TWE数量，延长培养的hMSCs都表现出典型的(B)形态和(C)扩增潜力。(D) hMSCs (P4)在IFN-γ刺激下通过分泌血管生成细胞因子表现出免疫调节潜能。图表表示每个条件下的单个数据点。

02   低温保存介质的组成影响解冻后hMSC功能

图2：低温保存介质的组成影响解冻后hMSC功能

由于在解冻后延长培养的hMSCs中没有观察到TWE效应，因此选择0和20 次TWE条件来评估短期功能，结果如图2所示。

通过使用核计数器NC-3000 (Chemometec)检测膜完整性，在所有测试条件下，冷冻保存的hMSC表现出相似的(A)细胞活力，(B)恢复率和(C)活力恢复。解冻后，将hMSCs转移到合适的培养容器中，促进细胞粘附和扩增。

在解冻后2小时更换培养基前对hMSCs进行显微镜成像。(D)与临床相关的HB制剂相比，在CryoStor冻存液中保存的hMSCs与培养容器的细胞粘附速度更快。该数据表明，低温保存介质配方和储存完整性可能会影响hMSC冷冻保存后的功能。

03   CryoStor冻存液改善解冻后细胞代谢恢复

图3：CryoStor冻存液改善解冻后细胞代谢恢复

在解冻后1小时、24小时和48小时，使用alamarBlue试剂评估解冻后hMSC的代谢活性，该试剂在代谢活跃的细胞中从非荧光resazurin转化为荧光resufin，如图3所示。(A)解冻培养48小时后，alamarBlue荧光在所有样品中均增加，但在CryoStor培养基中冷冻保存的hMSCs中荧光始终较高。

为了揭示TWE数量对48小时内hMSC代谢的影响，采用2-way重复测量方差分析(TWE x时间)对每个cryomedia组进行单独分析。(B)在HB低温培养基中冷冻的hMSCs表现出较高的样本变异性，在培养的48小时内细胞代谢没有较多增加。(C)相比之下，在CryoStor中冷冻的hMSCs在解冻后48小时显示细胞代谢增加较多。这一数据表明解冻后hMSC代谢依赖于冷冻期间使用的低温介质。

04   CryoStor加速解冻后线粒体形态的恢复

图4：CryoStor加速解冻后线粒体形态的恢复

线粒体是细胞内能量产生和代谢的主要部位。线粒体结构的范围从分支的网状网络到点状球，在组织和单个细胞类型之间存在差异。碎片化的球形线粒体表明线粒体应激或功能障碍，而高度分支的网络与更正常的线粒体代谢和能量产生有关，结果如图4所示。

(A)在正常培养条件下，未分化的hMSCs表现出绝大多数网状和高度分支的线粒体网络(MitoTracker红色荧光;细胞核用Hoechst 33342显像)。(B)在HB低温介质中保存的hMSCs在解冻后2小时表现出线粒体网络碎片化，表明细胞应激和代谢改变。

(C)相比之下，在CryoStor CS5中冷冻的hMSCs在解冻后2小时显示出增强的线粒体分支和更规范的网络。(D)线粒体网络的无偏自动图像分析显示，HB低温介质需要延长解冻后培养时间以使线粒体网络结构正常化(表示为中位分支/线粒体)。相反，在CryoStor CS5中冷冻保存的hMSCs在解冻后2小时和延长培养后表现出数值上相似的线粒体分支程度。在3-5个显微镜视野下对所有细胞进行线粒体网络分析。

4   研究结论

01   RoosterBio BM-hMSCs在低温保存后可保持稳健的细胞扩增和免疫调节功能；

02   RoosterBio BM-hMSCs在GMP制造的CryoStor CS5培养基或含有增加DMSO浓度(10%)的传统“自制”介质中冷冻保存时，可抵抗高达-110℃的轻度和缓慢的储存温度偏差(<20 TWE)；

03   优化后的细胞内样CryoStor CS5在较低的冷冻保护剂DMSO浓度为5%，而“home brew”中DMSO为10%的情况下，提供与“home brew”低温保存液相当的解冻后生存能力；

04   经过优化的CryoStor介质加速了低温保存后细胞功能的恢复，解冻后培养过程中的细胞粘附/扩散以及解冻后48小时细胞代谢的较大改善；

05   CryoStor介质有助于解冻后hMSC线粒体结构的快速恢复；

06   基于膜完整性的解冻后细胞活力测量可能不能指示hMSC健康，可能需要在解冻后立即进行额外的细胞健康测量；

07   这些数据表明，优化的冷冻保存可以改善解冻后hMSC的功能，减少解冻后延长“挽救”培养的需要，从而可能提高基于hMSC的治疗的临床疗效。

BioLife Solutions品牌

CryoStor冻存液产品特点及优势

1   CryoStor专有冷冻介质产品用于生物制品在-70至-196°C的冷冻保存

2   无血清、无蛋白、无动物源性成分；更高质量组分，美国FDA主文件

3   应用于脐带血干细胞，T细胞、MSC细胞、iPSC细胞、DC细胞等细胞的冻存保护

4   规格多样：瓶装多种规格和袋装的100ml/1000ml规格

5   与商业和企业自制的冻存液替代品相比， CryoStor提高了细胞活力viability和功能恢复recovery

6   全球近670+IND申报案例，20+新药申报案例

CryoStor系列冻存液产品清单

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参考资料

Hawkins et al. The Effect of Cryomedia Selection and Transient Warming Events on Post-Cryopreservation Human MSC Function-Poster