精进细胞转染工艺：关键优化方向及其必要性的探讨

细胞转染技术在基因治疗和细胞治疗开发中扮演着重要角色，为提高转染效率和病毒包装产量，研究者们往往需要对转染工艺中的多个参数进行优化（如下图）。

小编在之前分享的《细胞转染优化方向（一）》中已经描述了在转染过程中对细胞培养基、细胞密度、细胞质量等进行优化对细胞转染过程的重要性，本期小编会进一步探讨其它几个关键优化方向。

一、质粒比例

在进行慢病毒（LV）或腺相关病毒（AAV）的包装时，质粒比例对确保转染过程中质粒载体和目标基因的有效传递十分重要。当质粒比例不恰当时可能导致病毒衣壳蛋白含量偏高或导致病毒遗传物质含量偏高，造成虚假的滴度结果。

与此同时，通过这种方式组装形成的病毒活性粒子数也会下降，这在研究者们看来不仅表现出较低的转染效率，而且会导致空壳率增加，对下游的纯化工艺也随之造成更大的挑战。

目前对于大多数比较成熟的企业而言，对项目中的质粒比例的优化是重中之重，很多企业也都有自己独特的参数；然而，对于很多新手而言，往往不明确某一特定参数。这里小编给新手朋友们一些建议：对于三质粒系统包装AAV而言，可尝试使用：Ad plasmid：Rep+Cap plasmid：transfer targetd gene= 2：1.5 ：1（图1）

图1 - 不同质粒比例对转染效率的影响

二、质粒DNA与PEI的比例

质粒DNA与PEI的比率能够直接影响DNA与PEI形成的二元复合体的稳定性以及细胞的转染效率。

当二者之间的比率过低时，会导致二元复合体不够稳定，从而会引发质粒DNA在细胞外脱落、降解；与此同时也可能导致质粒DNA包封不足，质粒DNA以游离的形式存在，导致转染效率不足；反之，如果二者比率过高，则可能导致更多的PEI相互结合导致复合体过大，难以被细胞内吞；再加上游离的PEI本身对细胞也有更大的细胞毒性，影响细胞活力，进而导致转染效率下降。

所以，在进行病毒包装时质粒DNA与PEI的比例也是一大重要的影响因素。对于初次进行多质粒转染进行病毒包装的客户，小编建议从PEI与质粒DNA的比例为2：1开始。

图2 - 不同DNA：PEI比率对转染效率的影响

三、孵育体积

孵育体积也是影响转染效率高低的很重要因素之一，这主要是因为孵育体积一方面影响着质粒DNA与PEI二元复合体的形成，另外一方面也影响着二元复合体与细胞之间的有效接触。

举例来说，如果孵育体积过小，则可能会导致局部浓度过高，从而影响复合物的形成以及复合物的稳定性；另一方面也会导致与细胞培养基混合后原先孵育液中形成的二元复合体无法充分接触所有细胞，导致转染不均匀；反之如果孵育体积过大，则一方面可能降低了二元复合体形成的可能性，另一方面可能也稀释了二元复合体的浓度，也会降低二元复合体与细胞的有效接触，降低转染效率。

因此，在包装过程中小编建议整体的孵育体积维持在总培养体积的5%-10%。

图3 - 孵育体积与总培养体积比对转染效率的影响

四、孵育方式&时间

在转染过程中，小编更推荐采用AB液的形式，即将质粒DNA溶液与PEI溶液分别配置，然后将PEI溶液加入质粒DNA溶液中，注意，在这个过程中加入的顺序十分重要，否则可能导致形成的质粒DNA与PEI二元复合体颗粒不均匀，影响转染效率。

孵育时间是决定转染效率高低的另一重要因素。过短的孵育时间可能不足以使质粒DNA与PEI形成正确大小的二元复合体，降低转染效率；反之如果孵育时间过长则可能导致二元复合体粒径变大或细胞毒性增加，进而也导致转染效率降低、细胞死亡率增加。鉴于此，小编建议在利用PEI转染多质粒进行病毒包装时孵育时间控制在10-20mins区间。

五、病毒颗粒的收获时间

在进行病毒包装时，转染后病毒颗粒的收获时间不仅决定了最终得到的病毒滴度，而且决定了病毒颗粒的成熟度和稳定性。

当收获时间过早时可能导致宿主细胞还没有大规模生产病毒粒子，从而导致病毒滴度偏低且收获的病毒颗粒可能并未完全组装或成熟，影响其感染能力；当收获时间过晚时则可能导致病毒颗粒被降解或被细胞重新吸收，这也会直接影响到病毒载体的产量和质量，进而影响最终基因治疗的效果。

所以在这一因素下，实验者还是需要对不同的病毒包装时间进行测定，以找到更佳的病毒收获时间。针对于转染后的病毒收集时间，小编建议在包装慢病毒时可在转染后的48h后进行病毒收集；对于AAV病毒来说可在转染后的72h后进行病毒收集。

图4 - 不同病毒颗粒收获时间对产量的影响

六、质粒DNA的质量

除上述之外，质粒DNA的质量直接关系到转染复合体的形成和稳定性。不纯的质粒DNA由于含有杂质，如负电荷的蛋白质或其他分子，这些杂质会干扰PEI与DNA的结合，降低复合体的形成效率，甚至产生絮状沉淀。这不仅会降低转染效率，还可能导致实验结果的假阳性或假阴性。

综上，对细胞转染工艺中的各个参数进行优化是提高实验成功率和转染效率的关键。质粒比例、DNA与PEI比率、孵育体积、孵育时间、病毒颗粒收获时间以及质粒DNA的质量都是影响转染效果的重要因素。优化不到位可能会导致转染效率低下、实验结果不准确等。

因此，对这些参数的严格控制和优化是实现有效、稳定转染的基础。如需了解更多关于细胞转染的优化细节，欢迎联系上海77779193永利。

参考文献

1. Comparison of highly pure rAAV9 vector stocks produced in suspension by PEI transfection or HSV infection reveals striking quantitative and qualitative differences

2. Production of Recombinant Adeno-associated Virus Vectors Using Suspension HEK293 Cells and Continuous Harvest of Vector From the Culture Media for GMP FIX and FLT1 Clinical Vector

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