发布时间：2024/09/04 点击数：评价体外人类肺泡和支气管微生理系统在预测吸入性肺部药物的渗透性和吸收方面的能力
结论速览
肺MPS培养（也称为肺芯片，Lung-chip）比传统的静态培养更准确地模拟了人类肺组织的生物学和结构。
肺泡MPS对吸入化合物的ADME特性的预测比静态或离体临床前方法更为准确。
引言
肺是易受感染和损伤的内部器官，因为它不断暴露于环境中的吸入颗粒和病原体。与此相对应，呼吸系统疾病是导致死亡和残疾的主要原因之一。
呼吸系统疾病在全球十大主要死因中占据三席，包括慢性阻塞性肺病（COPD）（第3位）、下呼吸道感染（第4位）和肺癌（第6位）[1]。然而，新治疗方法进入市场的可能性只有3%，而其他疾病治疗方法的这一比例为6-14%[2]。
这种需求与治疗产出之间的差距部分可以用缺乏能准确预测药物反应的、与人类相关的临床前模型来解释。CN Bio 的PhysioMimix 器官芯片（OOC）系列微生理系统（MPS）代表了一种新颖但已被证明成功的体外肺模型系统：通过结合灌流、原代细胞共培养和气液界面（ALI）实现这一目标。
方法
将原代人类小气道或支气管肺细胞在气液界面（ALI）下，在传统静态条件或在MPS（PhysioMimix OOC和Barrier (MPS-T12) 板）下进行灌流培养14天。
通过显微镜观察培养物，并使用qPCR分析细胞分化。在Transwell基底侧添加内皮细胞层，并分析共培养物的组织结构和表型。随后，使用荧光黄色分析共培养物的表观渗透性（Papp）。
将三种具有不同性质的吸入性肺部药物以小体积液体剂量应用于肺泡共培养物。通过液相色谱-质谱联用（LC-MS）分析渗透性和吸收性。
结果与人体临床试验数据以及静态体外和离体数据进行比较验证。
结果
1、肺泡微生理系统（MPS）在生物学和结构上比静态培养更接近人类肺泡（下图）。
图1：
A. 使用PhysioMimix系统的肺泡MPS示意图，显示了人类原代肺上皮细胞、内皮细胞和免疫细胞的位置。每个孔下方有一个微型泵，用于提供培养基循环。
B. 静态和MPS原代肺泡上皮细胞单一培养物进行切片并用H&E染色。比例尺，50 μm。
C. 静态和MPS培养物在14天ALI培养期间的TEER分析。
D. qPCR分析肺泡培养物中AQP5（ATI）和SFTPB（ATII）的表达。
E. 肺泡MPS培养物固定并染色，分别用于RAGE（ATI，绿色）或SFTPB（ATII，黄色）、鬼笔环肽（肌动蛋白，洋红色）和DAPI（DNA，蓝色）。比例尺，100 μm。
在测试了四种已知的肝毒性化合物（奈法唑酮nefazodone、双氯芬酸diclofenac、曲格列酮troglitazone和西他生坦sitaxentan）后，人类OOC/MPS模型成功地将所有化合物鉴定为真正的阳性，并显示出与临床中检测到的ALT升高相似的结果（表1），从而强调了该人类肝脏OOC/MPS模型在临床转化中的可行性。
2、支气管MPS在假复层上皮（pseudostratified epithelium）中产生更接近人类相关细胞组成的组织，比静态培养更具优势（下图）。
图2：
A. 使用PhysioMimix系统的支气管MPS示意图，显示了人类原代肺上皮细胞、内皮细胞和免疫细胞的位置。每个孔下方有一个微型泵，用于提供培养基循环。
B. 静态和MPS原代支气管上皮细胞培养物进行切片并用H&E染色。比例尺，50 μm。
C. 静态和MPS培养物在14天ALI培养期间的TEER分析。
D. qPCR分析支气管培养物中SCGB1A1（杯状细胞）和MUC5AC（粘液细胞）的表达。E 支气管MPS培养物固定并染色，用于乙酰化α-微管蛋白（纤毛，黄色）、MUC5AC（粘液，绿色）、鬼笔环肽（肌动蛋白，洋红色）和DAPI（DNA，蓝色）。比例尺，100 μm。
3、上皮和内皮共培养的MPS在保持与人类相关的细胞表型的同时，增强了屏障完整性（下图）。
图3：
A. 与肺内皮细胞共培养的人类原代支气管上皮细胞进行切片并用Alcian Blue染色。比例尺，50 μm。
B. 共培养的支气管MPS固定并染色，使用乙酰化α-微管蛋白（黄色）、MUC5AC（红色）、鬼笔环肽（绿色）和DAPI（蓝色）。使用ImageJ/Fiji进行3D重建共聚焦图像。
C. 在ALI后14天分析单独上皮细胞、单独内皮细胞和共培养MPS培养物的TEER值。
D. qPCR分析支气管共培养物中SCGB1A1和MUC5AC的表达。
E. 支气管共培养MPS培养物固定并染色，用于乙酰化α-微管蛋白（黄色）、MUC5AC（绿色）、鬼笔环肽（洋红色）和DAPI（蓝色），并使用共聚焦显微镜成像。比例尺，100 μm。
F. 与肺内皮细胞共培养的人类原代小气道上皮细胞进行切片并染色，分别用于SFTPB（绿色）、鬼笔环肽（洋红色）和DAPI（蓝色）。比例尺，20 μm。
G. qPCR分析共培养的肺泡MPS培养物中AQP5和SFTPB的表达。
4、肺部MPS准确预测各种吸入性肺部药物的ADME特性（下图）。
图4：
A. Lucifer Yellow在支气管和肺泡共培养MPS或静态培养中的表观渗透性（Papp）。
B. 120分钟内肺泡（上）或支气管（下）培养物中累积的Lucifer Yellow量。
C. 研究中使用的吸入性肺部药物（沙丁胺醇、奥达特罗和氟替卡松）的生化和临床特性。
D. 24小时孵育后，药物在Transwell单独或MPS培养隔室中的定位百分比，包括内皮（深蓝色）、上皮（红色）、基底培养基（青色）和顶端培养基（粉红色）。
E. MPS、静态或离体数据[3]的预测能力与人体临床数据[4,5]的比较。每个数据集的有效渗透性（Peff）相对于每种药物的Cmax、剂量和Tmax的临床数据绘制。
展望
未来的研究将致力于探索更多种类的化合物，并通过气溶胶化方法了解药物的沉积/溶解情况。
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参考文献
1. WHO (2020) Global Health Estimates
2. Barnes et al. (2015) Eur Resp Jrnl 45(5)
3. Eriksson et al. (2018) Eur Jour Pharm Biopharm 124 1-12
4. Sadiq et al. (2020) BJP 178: 4440-4451
5. Borghardt et al. (2015) BJCP 81:3
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