具有可调节支架材料的无涂层细胞培养屏障芯片

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AKITA的多功能细胞培养板，旨在开发用于临床前研究的体外屏障模型，适用于低通量和高通量实验。生物屏障建立在半透膜上，膜材料可以根据需要进行定制。通过肠道芯片模型，77779193永利测试了两种新的生物相容性支架材料，称为Bio-Spun。这些3D电纺纳米纤维膜——无论是可生物降解的（PDLGA-PLLA双层）还是不可降解的（聚氨酯或PU）格式——显示出与黄金标准二维PET多孔膜相似或更优的性能。此外，这些Bio-Spun支架不需要任何预涂层，这提高了使用的便利性，节省了时间，并避免了涂层引起的变异性。

引言

传统的体外方法在早期研究中提供的结果在评估人类药物或治疗时可靠性较低。这些方法使用在塑料或玻璃基质上的传统二维细胞培养，只能部分再现复杂的细胞外基质和施加于组织上的机械力（Yuste等[1] ，2021）。细胞需要非常特定的培养条件和刺激才能如同在体内一样发挥功能。

AKITA Plate旨在重现组织和生物界面的微生理条件。微流控技术的使用使得双向流动成为可能，从而增强了生物屏障的完整性和组织的成熟度。AKITA Plate无需管道，且兼容标准细胞培养格式，可用于手动或自动设置，从低通量到高通量。AKITA Plate还设计用于与多种细胞培养基质结合使用。结合AKITA Plate的新型细胞培养支架和聚合物的最近开发，为生成更符合体内细胞应力和应变的三维体外模型开辟了新途径。这包括常用的不同孔径和涂层的二维PET膜，以及提供更好和更现实模型的可生物降解和生物相容的三维支架。

BioSurfaces, LLC（BioSurfaces）开发了一种名为Bio-Spun的创新三维支架，该支架由无动物成分的纳米纤维生物相容材料制成，可选择为可降解或不可降解。Bio-Spun支架用于创建多种细胞系的三维组织模型，被认为是一种更具成本效益、可重复且可靠的三维组织培养方法。

通过将AKITA Plate的微流控特性与BioSurfaces的不可降解PU和可降解PDLGA-PLLA Bio-Spun膜结合，研究人员可以获得一个可控且可定制的环境，用于研究生物屏障。这种结合可能提供更高可重复性和更可靠预测体内细胞对潜在药物疗法甚至化妆品成分反应的体外结果。这最终可能会推动新疗法和改进疗法的更快和更具成本效益的发展，与传统动物试验相比，在人体临床试验中失败的概率更低。

材料与方法

AKITA Plate准备：

96孔格式的AKITA Plate包含24个独立测试单元，可以在微通道内进行动态流动培养，或在开顶室内进行静态培养。AKITA Plate的半透膜（图1）由BioSurfaces制造，采用可生物降解的纳米纤维Bio-Spun PDLGA-PLLA双层膜（厚度12微米）或不可降解的纳米纤维PU支架（厚度10微米），并与商用的细胞培养级二维PET膜（It4ip，具有3微米蚀刻孔，厚度10微米）进行比较。

图1：AKITA微流控板设计

AKITA Plate开发为标准的96孔和384孔板格式。它们允许高通量处理，并提供易于操作的系统。通过AKITA WAVE摇动系统实现的控制流动，增强了器官芯片模型的成熟度、紧密性和生物相关性。

细胞培养、涂层、细胞种植、屏障渗透实验、共聚焦成像方法略，如需要请联系77779193永利获取。

结果

01   Bio-Spun PU和PDLGA-PLLA支架的Keyence图像

使用AKITA 96孔板监测Caco-2细胞在PET膜（对照）与BioSurfaces制造的PU和PDLGA-PLLA支架上的增殖和屏障形成情况。Bio-Spun PU支架通过一种专有工艺制造，该工艺涉及静电纺丝基于聚碳酸酯的聚氨酯。每个孔中Bio-Spun PU的表面拓扑在Keyence激光显微镜图像中显示（图2）。彩色箭头表示选定用于纤维测量的不同区域。该支架的平均纤维直径为496纳米（±81纳米）。Bio-Spun PDLGA-PLLA是一种可生物降解的双层支架，顶侧含有PDGLA，基底侧含有PLLA。该支架在静电纺丝后进行后处理，以在顶侧提供熔合拓扑结构。PLLA基底侧的纤维直径为588纳米（±94纳米）。

图2.对照PET膜的表面拓扑为具有3微米孔的薄膜。相比之下，Bio-Spun PU支架两侧的拓扑结构相似，平均纤维直径为496纳米。Bio-Spun PDLGA-PLLA双层支架具有两种不同的拓扑结构，支架在后处理中熔合了PDGLA顶侧的纤维。PLLA侧的表面形态与PU支架相似（图像放大150倍）。

02   第14天Caco-2上皮的共聚焦显微镜图像

通过Calcein染色的活体成像（数据未显示）监测了Caco-2细胞在整个实验中的增殖情况。第14天，通过共聚焦显微镜直接在Akita Plate中观察上皮细胞的汇合度和厚度（图3）。用鬼笔环肽进行的肌动蛋白染色显示，大多数条件下Caco-2培养物是汇合的。有趣的是，所有纤维连接蛋白涂层的支架显示出较厚的Caco-2上皮，类似于未涂层的PDLGA-PLLA支架（图3）。这表明这些条件更适合Caco-2细胞培养。相比之下，未涂层和涂有胶原蛋白的PET膜由于细胞附着性差和上皮脱落而未在图3中显示。

图3.第14天细胞的共聚焦成像，细胞染色为肌动蛋白（红色，鬼笔环肽）和细胞核（蓝色，DAPI）。多种支架（Bio-Spun PU和PDLGA-PLLA支架，对照PET）涂有纤维连接蛋白（Fib）、胶原I型（Col-1）或未涂层。由于细胞附着性差，涂有胶原I型或未涂层的对照PET膜未显示。共聚焦成像直接在固定于AKITA板中的细胞上进行。比例尺为100微米，PET膜为70微米。

03   在不同材料上形成的Caco-2屏障的通透性测定

能够注意到，从第7天起，所有支架和PET膜以及各种涂层都形成了紧密的10E-6 cm/s屏障，仅有的例外是纤维连接蛋白涂层或未涂层的PET对照膜（图4）。可以观察到，Bio-Spun PU和PDLGA-PLLA支架在未涂层的情况下表现出相似的通透性性能（图4）。这为无涂层细胞培养开辟了新的途径，结合了使用方便、节省时间和避免涂层引起的变异性。

图4.通透性测定使用0.4 kDa的荧光素钠盐进行。由于疏水性，未涂层的PET对照值未显示。虚线表示平均空白（无细胞）通透性。实验以三次重复进行。

04   无细胞通透性

无论涂层如何，所有支架和PET膜在无细胞的情况下显示出相似的通透性值（图5）。这确认了Caco-2的高紧密性是由上皮细胞引起的，而不是由不同的膜/支架物理性质造成的。

图5.通透性测定使用0.4 kDa的荧光素钠盐进行。实验以三次重复进行。注意，不同涂层和膜/支架材料的通透性评分没有明显差异。

结论

在AKITA板上的Caco-2肠道屏障模型在短时间内通过多种支架类型显示了紧密的屏障建立。与PET膜相比，77779193永利证明了Bio-Spun PU和PDLGA-PLLA支架在形成紧密的Caco-2上皮屏障时不需要任何涂层。这为无涂层屏障的生成开辟了新的可能性，增强了使用的便利性，节省了时间，并避免了涂层引起的变异性和成本。

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