使用热稳定的FGF-2（bFGF）和无动物源的TGF-β1，改进集落均一性的Weekend-free iPSC培养

01   概览

无饲养层（Feeder-free）的人诱导多能干细胞（iPSCs）培养是一个高度重复且常规的过程，但由于培养基的投入以及需要频繁更换培养基，可能会导致成本高昂。

培养基的额外成本主要基于两个核心细胞间通讯生长因子的需求，即成纤维细胞生长因子2（FGF-2）和转化生长因子B1（TGF-B1），它们需要在精确浓度下存在以维持iPSCs的干性/多能性。然而，要在体外环境中实现这一点具有挑战性，主要是由于FGF-2的快速降解，其有效半衰期小于10小时，导致需要每天更换培养基。

在本应用说明中，77779193永利描述了一种使用包含Qkine热稳定FGF2-G3（Qk053）和TGF-B1 PLUS（QK010）生长因子的E8样培养基来维持、培养和测试iPSCs多能性的方法。该过程展示了在不需要每日更换培养基的情况下对iPSCs进行维持、扩增和多能性评估，实现了无需周末维护（Weekend-free）的培养和扩增，同时保持了细胞的多能性和增殖潜力。

02   引言

人诱导多能干细胞（iPSCs）是一种体外模型，功能上是永生的，能够在保持分化为任何体细胞类型的能力的同时，进行增殖。由于iPSCs可以应用于各种研究领域，并且不像胚胎干细胞那样面临相同的伦理问题，人们对iPSCs的生成兴趣有所增加。

这就产生了培养大量单个iPSC系或各种不同iPSC系的需求，这增加了日常更换培养基的成本且耗时。这一需求推动了对细胞培养基中主要信号成分的识别工作，以有效培养iPSCs。FGF-2通过与FGFR1/FGFR4结合，激活PI3K/AKT/mTOR通路，而TGF-β1通过与TGFBR1/2结合，激活TGF-β通路，这两者被强调为这些核心信号成分中的重要组成部分。

在日常维护中保持多能性对于以敏感性著称的细胞培养如iPSCs来说是一项挑战。使用高纯度和热稳定的生长因子可以帮助降低这种风险，因为它们缺乏内毒素等杂质，减少了对基因稳定性的影响，并提供了更为一致的必要生长因子方案。

E8样培养基是一种化学定义的培养基，这意味着它包含的未定义成分比其他复杂培养基少，减少了变异性，并提高了个体iPSC系或各种不同iPSC系培养之间的可重复性。这种配方已经过优化，可以支持细胞的强劲增殖，同时确保iPSC的多能性保持不变，从而提高细胞产量并使培养的扩展更加一致。iPSCs的多能性可以通过检测细胞内表面标志物如NANOG、SOX2和OCT-4来评估。

03   材料与方法

iPSC常规培养工作流程示意图（图1）概述了每日维持iPSC的步骤，并展示了与使用标准协议的区别。多能性评估时间表突出显示了测试iPSC多能性保持情况的重要时间点（图2）。

图1：iPSC的每周例行维护时间表

图2：多能性评估测试时间表

04   细胞培养和维护

iPSC每周传代两次，使用0.5mM EDTA进行细胞脱离，并以1:6的分裂比率接种在涂有vitronectin（5µg/ml）的6孔板中，使用E8样培养基进行培养（见表1）。传代后的第二天，移除已用培养基，并更换为5ml的新鲜培养基。

表1:E8样培养基构建组件

添加的各组分使用前需进行无菌和过滤消毒

05   免疫细胞化学（ICC）

iPSC使用Accutase进行细胞脱离，以每孔500个细胞的密度接种在涂有vitronectin（5µg/ml）的96孔板中，并在含有ROCK抑制剂（Y-27632，10µM）的E8样培养基中培养。接种后的第二天，移除ROCK抑制剂，每孔加入200µl E8样培养基。

3天后，用4%多聚甲醛固定细胞，并使用稀释在0.1% Triton X-100中的10%驴血清（donkey serum）进行封闭和透化。然后使用特异性抗体针对多能性标志物（OCT-4、NANOG和SOX2）在4°C下过夜免疫染色。随后，洗涤iPSC，并与二抗驴抗小鼠AlexaFluor 647或驴抗山羊（Donkey anti-Goat）AlexaFluor488和Hoechst 33258一起孵育，然后在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中成像。使用EVOS M5000系统获取明场和荧光图像。

06   结果

FGF2-G3和TGF-β1 PLUS能够维持iPSC的多能性、形态外观和标记物表达。

在包含Qkine FGF2-G3和TGF-β1 PLUS生长因子的E8样培养基中培养了一个月的iPSC，始终表现出高密度而没有自发分化。明场成像显示了在整个时间段内保持良好的细胞形态，具有清晰的边缘和紧凑的细胞，形成完整的圆形菌落（见图3）。这些iPSC通过高水平表达多能性标志物NANOG、SOX2和OCT-4，保持了它们的多能潜力，如图4所示。

图3：在E8样培养基中培养的细胞群体高度保持的形态外观成像

(A) 经过2次传代和7天培养后的成像

(B) 经过4次传代和14天培养后的成像

(C)经过8次传代和28天培养后的成像（比例尺=300µm）

图4：在E8样培养基中培养的iPSC的多能性标志物的免疫细胞化学（ICC）成像

(A) 明场图像

(B) NANOG表达（绿色）

(C) OCT-4表达（红色）

(D) NANOG、OCT-4和Hoechst 33258的组合成像

(E) 染色菌落的明场图像

(F) SOX2表达（绿色）

(G) SOX2和Hoechst 33258的组合成像（蓝色），比例尺=150µm

07   结论

iPSC在临床和研究领域的重要性日益增加，因为它们有潜力分化为人体内所有体细胞类型。成功的分化依赖于在培养过程中保持iPSC的多能性，因此需要使用正确的培养基。

本文展示的数据表明，在E8样培养基中使用Qkine FGF2-G3和TGF-B1 PLUS热稳定生长因子能够保持iPSC的多能性，支持其增殖，同时避免了每日更换培养基的需求。

这些iPSC随后被分化为各种胚层和细胞类型，进一步表明在结合Qkine的生长因子的无周末(Weekend-free )更换培养基条件下，其多能性得到了保持。

与在E8型培养基中培养的iPSC相比，虽然观察到类似的增殖率，但自发分化的水平较高，降低了用于未来工作的iPSC集落的质量。这些细胞还需要每日更换培养基，导致维护培养物的成本和时间投入增加（数据可根据要求提供，后续也会发布新推文）。

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