发布时间：2022/06/10 点击数：1 前言
随着美国食品与药品监督管理局 (FDA) 批准转基因猪的胰岛可用于人体移植，异种胰岛移植已成为具备显著价值和发展潜力的糖尿病治疗手段, 有望成为替代胰岛素的治疗Ⅰ型糖尿病的方法，彻底改变糖尿病的治疗现状。在使用异种或者同类种属胰岛的人类临床胰岛移植试验中，用于胰腺分离目的特定 GMP 级胶原蛋白水解酶毫无疑问是成功的关键因素之一。随着异种移植临床研究的不断深入，分离试剂和消化酶在异种移植中的作用日益突出。
2 实验方法
本篇中实验人员评估了两种 GMP 胶原酶：德国 Nordmark 的 GMP 级胶原酶 AF-1 GMP 以及 Roche 的 Liberase MTF C / T GMP 级和标准非 GMP 胶原酶 P(Roche) 在猪胰岛异种移植过程中用于胰岛组织解离的胰岛质量控制方面的比较。
主要是采用标准快速采集法从 16 ～ 17 月龄尤卡坦小型猪中分离出成年猪胰岛。从平均体重为 50 kg 左右的猪中提取出的 40 g 左右的胰腺组织，利用各组胶原酶进行胰岛组织解离，在胰岛分离培养后第 1 天进行一系列的胰岛质量控制评价，包括胰岛产量、胰岛尺寸 (IEQ)、胰岛活力 (吖啶橙/碘化丙啶) 和体外功能活力 (GSIS) 参数。
表1 组织消化和胰岛分离过程
3 三种胶原酶在胰岛移植的对比实验结果
3-1 图1胰岛产量比较各胶原酶组胰岛产率对比
为了比较不同消化酶组间胰岛产量的差异, 用三组胶原酶分离猪胰岛，并测量每克胰腺组织的胰岛产量，在 37℃ 的组织培养第 1 天计算胰岛当量 (IE)。培养第 1 天后，用胶原酶 P 分离的猪胰岛平均产生 8302±986IEQ/g ，共产生 337 400±42 341 IEQS。用 AF-1 GMP 级胶原酶分离的猪胰岛，平均产率为 16 586±1391 IEQ/g，共产生 723 013 +48 871 IEQS 。在 Liberase MTF C/T GMP 级组中，平均产率为 16 517±1127 IEQ/g ，总 IEQ 为 683 369±82 839(图 1)。总的来说三组相比：Liberase MTF C/T GMP 级胰岛分离物的产率显著高于胶原酶 P，但 GMP 级胶原酶 AF-1 组与 Liberase MTF C/T GMP 级组相比无显著差异。
图1 胰岛产量比较
3-2 各胶原酶组胰岛分离尺寸大小对比
组织培养 1 天后，DTZ 染色监测胰岛形态。通过比较胰岛大小分布，胶原酶 P 与其他两种 GMP 酶相比，小胰岛组织尺寸在 50-100um 区间分布的量明显较多。几组的区间分布比例分别是：胶原酶 P: 62 ±2.5%，Liberase MTF C/T GMP 级:45.0±3.38%，Nordmark 胶原酶 AF-1 GMP 级组:38.3±5.9%。胰岛组织尺寸在 100-150um 区间统计显示：胶原酶 AF-1 GMP 级组分布比例 (胶原酶 AF-1 GMP 等级:51.7 + 5.2%) 显著高于胶原酶 P（30.5±1.8%）和 Liberase MTF C/T GMP 级别:44.7±2.0%。总的来说，两组 GMP 级胶原酶与非 GMP 粗酶分离得到的胰岛大小尺寸比较中。GMP 级组中，Nordmark 酶比 Liberase MTF C/T GMP 级的分离获得胰岛更大。胰岛大小区间分布比例，尤其是小尺寸胰岛组织（胶原酶分离获得的胰岛越小，说明分离过程中胰岛的损坏和破碎越高）区间比例结果为：在 50 ～ 100 um 胰岛尺寸大小分布中，Nordmark 胶原酶 AF-1 GMP 级组较胶原酶 P 和 Liberase MTF C/T GMP 级胰岛的分布低。
图2 DTZ 染色胰岛形态监测 (X40) 及胰岛细胞大小分析
3-3 各胶原酶组胰岛分离活力对比
采用吖啶橙 (AO) 和碘化丙啶 (Pl) 染色，在培养第 1 天按照既定方案重复测定胰岛活力。胶原酶 P(82.7 + 1.3%) 组胰岛活力相对较低，但研究者发现两组 GMP 级胶原酶的分离得到的胰岛活力之间没有显著差异 (表 2)。
表2 GMP 级酶和粗酶组的胰岛产量总结
3-4 各胶原酶组胰岛分离功能对比
采用葡萄糖刺激胰岛素分泌法 (GSIS) 验证胰岛在低浓度 (60 mg/dL) 和高浓度 (300 mg/dL) 葡萄糖刺激下的体外动态功能反应。测定猪胰岛素水平，采用 ELISA 法分析，并以刺激指数 (Sl) 值表示。37℃ 培养第 1 天后，Nordmark GMP 胶原酶组分离的胰岛的 Sl 为 (4.73 + 0.23) ，Liberase MTF C/ GMP 级分离的胰岛 (3.87±0.12)，前两组均显著高于胶原酶 P 分离的 SI 值 (2.07±0.02)。与粗胶原酶 P 相比，其他两种 GMP 级组的刺激指数 SI- 胰岛功能水平均显著升高。备注：SI 刺激指数表现为高血糖时胰岛素分泌比低血糖时高。
3-5 各胶原酶组内毒素水平检测比较
内毒素浓度测定采用 Pierce LAL 显色内毒素定量试剂盒，分离的胰岛在冰中被声波探测了30秒。溶解后的细胞在冰上孵育 10 分钟检测内毒素水平。与胶原酶P相比，两组 GMP 级胶原酶分离得到的胰岛组织的内毒素水平均显著降低，符合低于 30 EU/mL 的标准。
图3 离体胰岛葡萄糖刺激指数
4 结论
本实验研究既验证了使用特定的组合 GMP 级胶原酶试剂进行成年猪胰岛分离用于异种移植试验的重要性，同时确定了如何从一个成年猪胰腺组织中分离获得足够数量的胰岛为临床胰岛移植提供重组准备的能力。最终证明 GMP 级胶原酶是一种高效的增加胰岛产量、大小，活力和功能的酶，并且可保持获得的胰岛组织在较低和可接受的内毒素水平。因此可认为这种可靠的、可重复使用的 GMP 级酶分离猪胰岛的方法，将为异种胰岛移植治疗Ⅰ型糖尿病提供极大的帮助。
