连接肠道和肝脏：用于临床前口服生物利用度剖析的人体相关性多器官微生理系统

亮点

美国知名体外模型公司Altis Biosystems利用CN-Bio的肠/肝多微生理系统（Gut-Liver MPS）构建体外模型并开发了一种化学成分限定、适应肠/肝共培养的培养基，成功预测两种目前的模型无法充分预测人体ADME行为的药物，并与文献中已发表的人类和动物数据进行了比较，突出了Gut-Liver MPS 具有更高的人体相关性生理条件。

前言

吸收(Absorption)、分布(Distribution)、代谢(Metabolism)和排泄(Excretion)，即ADME是指示药物给药后行为的四个关键过程，在表征化合物的药代动力学（PK）性质和生物利用度方面起关键作用。口服生物利用度是指药物在通过肠壁吸收和肝脏首过代谢后到达全身循环的比例。ADME和生物利用度在确定化合物的安全性和毒理学特征方面至关重要，因此是药物开发前临床阶段的重要测量指标。

目前使用一种简单体外检测方法来模拟肠道（如Caco-2细胞系）或肝脏（如肝微粒体和悬浮肝细胞），并结合体内动物模型来分析口服生物利用度。然而，这两种方法都存在较大局限性：

• Caco-2细胞一直是评估体外肠道渗透性的主力工具，但它们无法解释肝脏代谢，且该细胞系的酶和转运蛋白表达水平缺失或较低

• 肝微粒体和悬浮肝细胞用于体外药物代谢筛选研究，但它们不能顾及肠道吸收

总的来说，这些因素限制了其估算的准确性。此外，在一项对184种化合物的开创性研究中，发现动物模型与人类生物利用度的相关性较弱（R² = 0.34）[1]。因此，需要一种新的、与人类更相关的方法，结合口服吸收和肝脏代谢，以更准确地估算药物的生物利用度。

在过去的十年中，微生理系统（MPS），也称为器官芯片（OOC），显示出了提高ADME研究人类可翻译性的潜力。它们通过灌注在 3D 支架上培养人类原代细胞，以更生理相关的方式再现细胞和组织的结构和功能生物标志物。为了改善药物效力和安全性数据从体外到体内的转化，出现了更复杂的MPS，其中之一是多个器官（如肠和肝）通过液流连接在一起，以模拟药物吸收和首过代谢等过程[2]。

研究目标

在此，77779193永利引入了一种双器官微生理系统（MPS），该系统将77779193永利已经建立的人类原代肝脏MPS与人类肠道的原代模型连接在一起。对于肠道屏障，77779193永利从人类空肠中分离出原代细胞，并在仿生支架（RepliGut，Altis Biosystems）上进行扩增。为了将原代肠道和肝脏组织连接在一起，77779193永利开发了一种化学成分限定的培养基，可以支持双器官MPS中的这两种器官模型。这种培养基能够维持肝脏的代谢功能和肠道屏障的完整性。

通过使用已经深入研究的药物化合物，77779193永利的目标是展示这种原代肠/肝MPS在分析口服药物的ADME行为方面相比于等效的Caco-2肠/肝MPS，具有的更高预测能力。

研究方法

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结果与讨论

01   使用PhysioMimix多器官系统及其多芯片双器官板（图1），77779193永利建立了一个原代肠/肝MPS，以克服当前模型在人类相关性方面的局限性，从而更好地分析口服药物的生物利用度。

图1. 在PhysioMimix双器官板中标准肠/肝MPS的设置

A) PhysioMimix多器官系统及其多芯片双器官板的设置，展示了板内肠道和肝脏隔室的位置。每个板最多可以培养6个肠/肝模型。

B) 在Transwell插入物内的仿生支架上培养的RepliGut模型示意图，形成肠道上皮屏障。

C) 双器官板中肝脏隔室内流体流动的示意图。

02   在RepliGut模型（图2A）中，空肠干细胞和祖细胞在仿生支架上扩增至汇合，然后分化，导致屏障强度增加（图2B）。基因表达证实了相对于增殖期细胞，增殖细胞基因的下调和分化肠细胞基因的上调（图2B）。在分化阶段，RepliGut模型表达了组织特异性标志物，证实了肠起源以及紧密连接的标志物和粘蛋白，确认多细胞谱系（图2C）。通过组织学观察，分化后第7天观察到一层明确且连续的粘液层，证实了这一点。相比之下，在上皮细胞系Caco-2模型中未观察到粘液的产生（图2D）。为了评估RepliGut模型在改善预测能力方面相对于Caco-2模型的潜力，77779193永利研究了在药物代谢和活性药物转运中重要的主要代谢酶和转运蛋白基因的表达。与Caco-2细胞系相比，基因表达得到了改善（图2E）。

图2. 与标准Caco-2细胞系模型相比，RepliGut原代肠道模型更具人类相关性。

A) 从空肠样本中分离出隐窝上皮干/祖细胞，并在静态条件下的仿生支架上扩增。

B) 在RepliGut模型的扩增和分化阶段，通过TEER测量的屏障完整性和相对基因表达。

C) RepliGut模型的免疫荧光图像。屏障染色包括DAPI（深蓝色）、紧密连接蛋白ZO-1（浅蓝色）以及其他肠道标志物如MUC2（黄色）、微绒毛蛋白（紫色）和CDX2（绿色）。图像比例尺为CDX2的100微米和其他三个标志物的200微米。

D) RepliGut和Caco-2模型的组织学切片。单层横截面用苏木精和伊红染色以可视化细胞核，并用阿尔新蓝染色以可视化粘液层。

E) qPCR显示RepliGut和Caco-2模型中关键转运蛋白和代谢酶的相对基因表达。

03   两个或多个组织共同培养的一个挑战是，建立能够维持两种组织类型功能的条件。77779193永利设计了一种化学定义的培养基，添加到双器官板的Transwell基底侧和肝脏隔室中（图3A）。通过LDH释放、CYP3A4活性和白蛋白生产进行测量发现，这种培养基在共培养中至少48小时内维持了肝细胞的健康和功能（图3B-D）。在加入RepliGut模型到双器官板后，通过TEER（图3E）和Lucifer黄色通透性试验（图3F）进行测量发现，肠道屏障的完整性也在共培养的48小时内得以维持。

图3. 在原代细胞肠/肝共培养中维持肝脏和肠道功能性标志物。

A) 建立原代RepliGut/肝MPS的实验时间线。RepliGut首先在静态下独立培养13天，然后在PHH播种后4天被转移到PhysioMimix双器官板的Transwell隔室中。共培养在化学定义的培养基中维持48小时。在共培养的0、24和48小时测量肝细胞健康和功能性标志物，同时培养一个仅肝脏的MPS作为对照。77779193永利研究了B) LDH释放、C) CYP3A4活性和D) 白蛋白生成。通过E) TEER和F) Lucifer黄色的通透性评估肠/肝MPS中RepliGut的屏障完整性，并与在标准RepliGut成熟培养基中全程静态培养的独立RepliGut进行比较。

04   功能性进一步通过7-羟基香豆素（7-HC）给药（图4A）得以证明，7-HC，这是一种通过葡萄糖醛酸化进行II相代谢的荧光化合物，以展示在共培养模型中通过肠道屏障的吸收及其后的首过代谢。7-HC通过葡萄糖醛酸化进行代谢见图4B，肠道和肝脏组织共同参与其清除见图4C。

图4. 首过代谢可以通过原代细胞肠/肝MPS进行模拟。

A) 肠/肝MPS模型中7-HC给药的示意图。1 mM的7-HC被加入到双器官板的Transwell隔室的顶端，该隔室包含RepliGut屏障。随后7-HC穿过屏障进入在肠道和肝脏组织之间循环的培养基中。肠道对照组通过将RepliGut模型插入双器官板的Transwell隔室中（该隔室连接到一个空白的肝脏隔室，没有PHH）进行准备。同样，肝脏对照组通过将7-HC加入到Transwell隔室中的一个空白Transwell插入物（没有肠细胞）中进行准备。

B) 7-HC代谢的路径。7-HC通过UGT酶进行II相代谢，形成非荧光代谢产物7-羟基香豆素葡糖醛酸苷。

C) 随时间变化的循环培养基中7-HC浓度变化。

05   为了展示原代RepliGut/肝MPS相对于同等的Caco-2肠/肝MPS在预测能力上的改进，77779193永利研究了两种药物的ADME特性，这两种药物在动物模型和Caco-2细胞系中均未能准确预测其在人类中的ADME行为和生物利用度。

一：替莫卡普利（Temocapril），是一种设计为抗肠道水解的前药，通过羧酸酯酶1（CES1）代谢为替莫卡普利酸（Temopcarilat）（图5A）。人类中的同工酶模式已被很好地表征，肝脏和肠道分别表达CES1和CES2[3]。在Caco-2细胞中，由于主要表达CES1，导致药物清除率被高估（图5B-C）。相反，RepliGut模型更符合人类的CES1和CES2表达比例，使其在前药研究中更具相关性（图5G）。替莫卡普利的清除率通过口服和静脉给药进行分析（图5E）。静脉给药后24小时内肝脏迅速清除（图5F）。与肠道CES表达一致，原代RepliGut/肝MPS正确报告了替莫卡普利对肠道水解的抵抗性，并且在口服给药后48小时肠道顶端隔室中生成的替莫卡普利酸较少。

图5. 案例研究1，替莫卡普利。替莫卡普利在原代细胞肠/肝MPS中对肠道清除的抵抗性与人类肠道中的同工酶表达相关。

替莫卡普利被添加为口服剂量（100 µM）在Transwell的顶端，或作为静脉剂量（10 µM）直接混入肝脏隔室中的循环培养基中。研究了两种肠/肝MPS配置：Caco-2/肝和RepliGut/肝。替莫卡普利：

A) 主要通过羧酸酯酶（CES）1同工酶代谢成活性代谢物替莫卡普利酸。

B) 人类肝脏、小肠和Caco-2细胞系中CES1同工酶的RNA表达和C) 蛋白质表达模式。

D) 空肠模型中CES基因在扩增培养基（EM）和分化培养基（DM）中的时间表达模式；数据由UNC Chapel Hill的Scott Magness提供。

E) 在肠/肝模型中的循环培养基中替莫卡普利浓度随时间变化，采用LC-MS测量。

F) 仅肝模型中的替莫卡普利浓度随时间变化。

G) 各模型在48小时内所有隔室中的替莫卡普利总摩尔分数。H) 在药物给药后0和48小时，在两种肠/肝模型的肠顶端隔室中替莫卡普利酸代谢物的相对量。峰面积是化合物浓度的定性测量。‍

6   二：77779193永利评估了两种肠/肝MPS模型中咪达唑仑（Midazolam）的生物利用度，这是一种主要通过CYP3A4酶进行肠道清除的药物[4]。咪达唑仑在静脉给药后迅速被肝脏清除，反映出其高内在肝脏清除率（19 mL/min/Kg）（图6A）。与Caco-2肠/肝MPS相比，原代RepliGut/肝MPS对咪达唑仑的清除率更高（图6B）。原代RepliGut/肝MPS还提供了一个更接近人类临床观察的口服生物利用度估计（图6C）。

图6. 案例研究2，咪达唑仑。原代细胞肠/肝MPS与人类生物利用度的改善相关性。

咪达唑仑被添加为口服剂量（50 µM）在Transwell的顶端，在肠隔室内，或作为静脉剂量（5 µM）直接混入肝脏隔室中的循环培养基中。研究了两种肠/肝MPS配置：Caco-2/肝和RepliGut/肝。在48小时内取培养基样本并通过LC-MS定量，以确定：

A) 在不同药物处理方案后循环培养基中的咪达唑仑浓度和

B) 在各模型的所有隔室中48小时内剩余的咪达唑仑总摩尔分数。

C) 77779193永利通过计算曲线下面积和剂量的比率估算了两种肠/肝MPS模型的口服生物利用度，并与文献中发表的人类和动物数据进行了比较。

结论

这项研究表明，原代RepliGut/肝MPS更准确地再现了人体口服药物给药的生理条件。通过结合肠道吸收和肝脏代谢，原代RepliGut/肝MPS生成的药物浓度类似于体内，无法用标准的临床前体外模型复制。与Caco-2肠/肝MPS相比，原代RepliGut/肝MPS在研究通过CES代谢的前药的药代动力学方面提供了一种更准确的方法，而Caco-2肠/肝MPS未能准确描述这些药物在人体中的生物利用度。结果表明，原代MPS模型提供了一种可行的替代方法，可以克服Caco-2细胞系在这类药物上的人类相关性限制。通过在药物发现的早期阶段生成更具人类相关性的数据，可以在昂贵的临床前体内研究之前发现和解决问题。

由于原代RepliGut/肝MPS完全由原代人类细胞组成，不存在跨物种差异，因此该模型可用于帮助克服动物模型ADME预测与人类结果之间的低相关性。通过弥合体外试验和体内研究之间的差距，该模型使研究人员能够自信地推进最有前途的药物候选物，从而支持降低成本并减少所需的动物数量。

研究方法

在这里，77779193永利描述了一种双器官微生理系统（MPS），它将原代人类肠道（RepliGut Planar-Jejunum，Altis Biosystems,一种商业化表达紧密连接蛋白的极化肠上皮细胞单层。可以实现生理比例的所有主要细胞谱系）与原代人类肝脏芯片（CN Bio）连接在一起。该双器官MPS使用PhysioMimix多器官系统及其专用的“多芯片”双器官耗材板进行培养（图1A）。双器官板由六个孔组成，每个孔有两个隔室：（i）Transwell隔室和（ii）肝脏隔室。可以独立控制每个隔室（肠道和肝脏）以及器官之间互连通道中的流体流动（图4A）。

通过在涂有仿生支架的Transwell上扩增人类空肠干/祖细胞，并分化为由人类肠道中所有终末分化细胞组成的极化屏障，建立了肠道屏障。每48小时更换一次培养基，使用RepliGut生长或成熟培养基。通过每48小时进行的跨上皮电阻（TEER）测量或在双器官实验结束时确定Lucifer黄色穿透Transwell的通透性来评估肠道屏障的完整性。通过荧光显微镜确认了肠道起源标志物（Villin和CDX2）和紧密连接标志物ZO-1的表达。通过阿尔新蓝染色RepliGut Planar-Jejunum横截面以及在孔内对Muc-2蛋白进行免疫荧光染色，确认了粘液的产生。通过在Caco-2培养的第15天或RepliGut Planar-Jejunum分化后的第7天提取的RNA，评估了代谢和转运基因的表达。代谢酶和转运蛋白的基因表达通过使用TaqMan基因表达检测的qPCR测量，并使用ΔΔCT分析确定相对表达。

对于肝脏，将原代人类肝细胞（PHH）播种在PhysioMimix双器官板的肝脏隔室中，在多孔的3D胶原蛋白涂层支架上（图1C）。在第4天，PHH播种和微组织形成后，将分化的RepliGut培养物添加到PhysioMimix双器官板中，以建立肠/肝共培养。使用化学定义的培养基在至少48小时内维持肠和肝组织的功能性，在此期间添加化合物以研究其ADME特性。在这项研究中，77779193永利比较了原代RepliGut/肝MPS与Caco-2肠/肝MPS的性能。在第4天，PHH播种和微组织形成后，通过添加带有分化的Caco-2单层细胞（播种后15-17天）的Transwells到PhysioMimix双器官板中，建立了Caco-2肠/肝MPS。

77779193永利在概念验证研究中使用了7-羟基香豆素（7-HC），这是一种通过葡萄糖醛酸化进行II相代谢的荧光化合物，以展示在共培养模型中通过肠道屏障的吸收及其后的首过代谢。PhysioMimix双器官板允许在肠/肝共培养或仅肠（无PHH）和仅肝（无肠屏障，化合物加入到无细胞的空Transwell中）中灵活地进行化合物剂量研究。在本研究中，研究了两种现有模型无法预测其人类ADME特性的化合物（替莫普利和咪达唑仑）。在PHH播种后的第4天和肠组织添加到双器官板后，通过口服（药物添加到Transwell的顶面）或静脉注射（IV）（仅肝，药物混入共培养基中）给予化合物。分别在0、1、4、6、24和48小时取样，使用液相色谱-质谱联用（LC-MS）分析肝脏隔室中母体化合物的浓度。使用GraphPad Prism对口服和IV浓度曲线的曲线下面积（AUC）进行了估算。

参考文献

1.Musther, H., Olivares-Morales, A., Hatley, O. J. D., Liu, B. & Hodjegan, A. R. Animal versus human oral drug bioavailability: Do they correlate? European Journal of Pharmaceutical Sciences 57, 280 (2014).

2.Edington, C. D. et al. Interconnected Microphysiological Systems for Quantitative Biology and Pharmacology Studies. Sci Rep 8, (2018).

3.Imai, T., Imoto, M., Sakamoto, H. & Hashimoto, M. Identification of esterases expressed in Caco-2 cells and effects of their hydrolyzing activity in predicting human intestinal bsorption. Drug Metab Dispos 33, 1185–1190 (2005).

4.Paine, M. F. et al. First-pass metabolism of midazolam by the human intestine. Clin Pharmacol Ther 60, 14–24 (1996).