发布时间：2024/06/25 点击数：从人类诱导多能干细胞分化出神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞和小胶质细胞以形成神经组织芯片：一种用于评估来自间充质干细胞的细胞外囊泡治疗潜力的神经炎症模型
简介
干细胞技术的进步使得生成具有组织学、分子和生理特性的人类化三维 (3D) 模型成为可能，以及生产细胞衍生的治疗物，如细胞外囊泡 (EVs)。
在器官芯片平台和人类诱导多能干细胞 (hiPSCs) 衍生的神经/胶质细胞方面的改进，用于研究易于设置且快速输出的3D个性化神经组织建模。
本文重点介绍了从单一来源hiPSCs分化出神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞和小胶质细胞的重要步骤。
此外，77779193永利提出了一个定义明确的人类化神经组织芯片模型（如上图），该模型由具有相同基因背景的分化细胞组成，并展示了骨髓间充质干细胞 (BMSCs) 衍生的细胞外囊泡（EVs）的治疗潜力，以提出一种治疗神经炎症相关疾病的新方法。
大约100nm的CD9+EVs在肿瘤坏死因子-α (TNF-α) 诱导的神经炎症模型中，促进了更多的抗炎和细胞-细胞相互作用细胞因子的反应，有助于重新建模，这是模拟真实神经-胶质病理生理学的理想选择。
本文77779193永利将重点讨论神经芯片的构建过程，而单一来源hiPSCs分化出神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞和小胶质细胞的关键步骤则略，有需求的读者可联系77779193永利获取原资源。
神经芯片构建过程
用于血脑屏障支持的3D神经组织的微流控芯片平台是芬兰的AKITA，ByFinnadvance。每块耗材板至多可培养 32 个独立单元样品。每个培养单元包括一个微通道（位置 “2”）和一个位于两个培养基储存器（进出口，位置“1”）之间的培养室。
每个培养室通过一个薄膜水平分为两部分，用于内皮屏障，将下部培养室和开放式顶部培养室（位置 “3”）分开，用于3D组织培养构建（见图 1）。
图1：神经芯片的示意图
模拟脑内皮屏障的人脑微血管内皮细胞（hCMEC/D3）从下图位置“1”中开始种植，并经过培养在位置“2”贴壁。收集人类诱导多能干细胞预分化的四种主要细胞类型：成熟神经元（Mature neurons）、小胶质细胞（Microglia）、星形胶质细胞（Astrocytes）和处于可增殖阶段的少突胶质细胞（Oligodendrocytes），并以随机方式（按文献指定比例混合细胞类型）与Matrigel基质混合后种植在位置“3”从而形成3D神经组织。（详细方案可联系77779193永利获取原资源）
结果
1 ELISA结果显示神经芯片能正确反映促炎因子和外泌体EV处理后的抗神经炎症效果
如图2所示，促炎因子、IL-6(从65.5~116.5ng/L)和IL-1β(从15.3~21.5pg/mL)水平升高(p<0.01和p<0.001)与TNF-α水平的可升高至(p<0.0001；TNF-α诱导的神经炎症组在第2天结束时从61.6降至1722pg/mL)，而抗炎细胞因子IL-10水平(p<0.05，从232降至176ng/mL)与对照组相比下降，验证了神经炎症在神经组织芯片平台上的成功再现。
图2：神经芯片上清液中TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-10细胞因子的ELISA结果
之后，给其中一个TNF-α组注射ev。第5d时，TNF-α组TNF-α(从75.7~546.6pg/mL)、IL-6(从109.4~192.3 ng/L)和IL-1β(从15.7~17.8pg/mL)水平高于对照组(p<0.01、p<0.001和p<0.05)，3种细胞因子水平低于对照组(p<0.05~285.1pg/mL)。p<0.001~118.7ng/L，p< 0.05~16.5pg/mL)，与TNF-α组相比，EV组与对照组基本持平。
此外，TNF-α组IL-10水平下降(从254.8降至212.7ng/mL)，由于抗炎反应，EV给药后IL-10水平升高(p<0.01至287.6ng/mL)。
2 免疫荧光共聚焦显微镜图像显示神经芯片能正确反映促炎因子和外泌体EV处理后的抗神经炎症效果
如图3所示，接下来，检查神经芯片平台的主要“神经组织结构”，嵌入在3D水凝胶中，其中CD11b +小胶质细胞，TUJ1 +神经元细胞和GFAP +大胶质细胞(星形胶质细胞和少突胶质细胞)在对照组所描述的生理条件下相互通信。
在TNF-α治疗的第2天没有观察到相当大的致死效应，仅在组织和血脑屏障结构中引发炎症反应。TNF-α处理5天后，除了M1极化CD11b +小胶质细胞表现出促炎反应的数量较大程度增加外，在培养过程中，由于炎症反应的神经毒性作用，神经元和大胶质细胞失去了活力和通讯能力。
随后，给药EV增强CD11b +小胶质细胞的M2极化，显示出抗炎反应，并在共培养中保持TUJ +和GFAP +细胞通信和组织完整性。
图3：3D神经组织芯片结构的CD11b和TUJI/GFAP标记的免疫荧光共聚焦显微镜图像（ZeissLSM 880，比例尺100 um）
进一步表征神经组织芯片模型中的内皮，以确定暴露于TNF-α是否会导致较大变化(图4)。对照组多数ZO-1+和CD-31+细胞在芯片上形成强大的内皮屏障。
TNF-α处理导致CD-31+细胞数量减少，这是由于炎症反应依赖的细胞毒性，内皮细胞屏障的破坏，最终导致存活细胞中ZO-1表达减少，而存活细胞中β-catenin表达没有明显变化。
然而，TNF-α组给予ev可促进CD-31+细胞的存活，抑制ZO-1+内皮屏障的破坏，并增加E-cadherin+细胞群，并具有抗炎反应。
图4：BBB屏障的CD-31/E-钙黏蛋白和ZO-1/β-连环蛋白标记，在处理5天后的亮场图像（MoticAE31E，比例尺100 um）和z-stack（合并所有通道的正交保护后的所有通道的亮场图像）
3 qRT-PCR分析定量反映神经芯片正确反映促炎因子和外泌体EV处理后的抗神经炎症效果
除了定性结果外，根据qRT-PCR分析的折叠调节数据，还定量考虑了“神经组织构建”中促抗、抗炎、存活、神经元、小胶质和大胶质标记基因的上调和下调（图5）。
与对照组相比，TNF-α介导的结果是，随着TNF-α mRNA的表达，其他主要促炎、激活和/或共刺激标志物的表达水平分别增加，给药后，促炎标志物较大程度降低。TNF-α组CD86表达升高3.91倍，TNF-α/EV组在EV给药后CD86表达降低1.42倍。
另一方面，在炎症条件下激活的凋亡标志物Caspase-3的表达水平在TNF-α组中升高，这证明了组织构建中细胞的损失，然后由于EV给药的构建作用而降低。
图5：qRT-PCR基因表达和基因富集分析在神经组织芯片模型中外泌体给药的抗炎效果热图显示；红到绿的比例表示Log2倍数变化的减少，A:TNF-α处理的组织与对照组织相比，B: 外泌体给药的TNF-α处理组织与TNF-α处理的组织相比（n=2，独立重复=2）
结论
综上，在这项研究中，77779193永利重点展示了一个由相同遗传背景的分化细胞组成的、支持血脑屏障的明确人源化神经组织芯片模型，该模型更高通量且具功能性，能够评估骨髓间充质干细胞（BMSCs）衍生的细胞外囊泡EV的治疗潜力，以提出一种治疗神经炎症相关疾病的新方法。
单一来源的hiPSCs分化神经/胶质细胞的关键点可联系77779193永利获取原资源。
总部设在芬兰奥卢的器官芯片制造商AKITA，by Finnfadvance，成立于2019年。系统搭载拥有高通量器官芯片板，该板可被设计成单器官和多器官，兼容多种成像模式，高人体相关性的下一代人体体外模型，加速药物开发，降低临床前试验失败的风险，也可用于个性化医疗。
77779193永利是AKITA，by Finnfadvance官方授权的中国经销商。
AKITA工作流程：下图为主要步骤的简化工作流程图，且每种实验都有特定型号的详细SOP。
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