良好生产规范(GMP)的基本原则中曾对于使用无菌封闭系统进行细胞治疗产品的加工、储存和转移有一系列建议，而低温保存（-80℃--196℃）是细胞转移比较有效的方法。下文将评估一种新的封闭系统无菌冻存管设备-美国Sexton品牌CellSeal无菌冷冻冻存管（下图）在低温冷冻存储条件下用于保证细胞治疗产品的安全低温保存和存储的性能。

图-美国Sexton品牌CellSeal无菌冷冻冻存管

美国Sexton品牌CellSeal无菌冷冻冻存管的主要特点：

•  CellSeal用途：

-细胞制剂的药包材容器（直接接触药品的包装容器）

•  CellSeal结构设计：

CellSeal无菌冻存管精密设计，结合了冻存袋和硬瓶的优点，满足细胞治疗行业需求

•  CellSeal选材考究：

美国药典高等级的医用塑料USP Class VI，选材考究，耐低温、耐DMSO、抗断裂

•  CellSeal药包材测试清单齐全：

批次放行测试清单、设计测试项目清单以及其他冻存管制造过程控制等清单

•  CellSeal世界范围内已有丰富的IND和BLA案例：

十几个国家40多种IND药物，2个上市药物（中国及美国）

Sexton品牌CellSeal和Corning冻存管比较

CellSeal和Corning冻存管中的细胞当使用10% DMSO的冷冻保护剂CPA时，细胞在-85℃冰箱中(a)和37℃水浴(B)中变化的温度-时间变化曲线。可见两种冻存管中细胞皆可以遵循细胞冻存及复苏的慢冻速溶基本原则，从而为较好的保存细胞活力提供可能，包括在细胞冷冻存储和解冻过程中，细胞存活率参数的水平需多关注。

进一步的，采用人脐带血造血祖细胞(HPC-Cord)、牙髓间充质干细胞(DPSCs)和子宫、内膜间充质干细胞(ERCs)来确定无菌冻存管（左边是CellSeal，右边是Corning）的性能。

图2: 显微镜下观察在CellSeal和Corning 冻存管中冷冻保存的DPSCs和ERCs的贴壁和扩增状态

图3：用10% DMSO和Cryostor(CS-10)作为CPA冷冻保存时，在CellSeal和Corning小瓶中DPSCs和ERCs解冻后的细胞活率

如上可知美国Sexton品牌CellSeal无菌冷冻冻存管可作为储存和运输的生物材料的临床应用的一种封闭系统低温设备。与市场上已有的对照产品-康宁冻存管相比，CellSeal中细胞的冷却和解冻速度以及解冻后的存活率无过大差异。

CellSeal无菌冷冻冻存管在作为一种MSCs细胞制剂临床用药包容器的应用

对于“ 现货型” 的异体临床移植或输注治疗应用，通常需要大量冷冻储存的MSC。在治疗过程中在常用的细胞浓度下冷冻会产生大量含有不良数量DMSO的制剂产品。因此高浓度细胞冷冻可减少输注DMSO的总量，进而可降低输注相关毒性的发生率。

图-基于Sexton CellSeal无菌冷冻冻存管的冷冻ASC的临床方案流程

本研究的目的是确定在降低DMSO浓度下低温保存高浓度间充质干细胞是否会对脂肪来源成体干细胞(ASC)的存活率、干细胞特性和体内移植潜力产生不利影响。在研究中作为药包容器用途的CellSeal封闭系统冻存管中细胞制剂冻存液中的DMSO最终浓度为5%v/v，细胞浓度为1 000万/mL，用被动冷却系统以1℃/min降温速度下程序性降温至-80°C左右，然后将此含有5%DMSO高浓度细胞的CellSeal冻存管转入液氮LN2环境中长期保存（本次实验保存时间为1周）。解冻后的细胞被稀释并分析其活力和功能。如图4所示解冻后，细胞可一步稀释到等渗回输用培养基中（免洗），最终DMSO浓度为0.45%，不会因为离心或清洗而损失细胞。

图A&B：CellSeal冻存管中不同种类细胞和CPA（DMSO）浓度条件下在-85℃冰箱中被动冷冻和在37℃的水浴中加热升温时所经历的温度-时间曲线

液氮LN2环境下保存一周后，在不同细胞和CPA浓度下冷冻保存的CellSeal冻存管中ASC解冻后的即时活率和细胞回收数量统计如下表1和表2。

不同细胞数量和CPA浓度下冷冻保存的ASC解冻后的克隆性(CFU-F)能力如下图6和表3：

不同细胞数和CPA浓度下冻存ASC解冻后的分化潜力如下图7：

继续的对于以1000万/mL细胞浓度组冷冻保存的ASCs解冻后进行流式细胞术FACS分析相关表面maker表达，结果如下：

可以发现复苏后的ASCs大部分都表达CD105、CD73和CD90，不表达CD45、CD34等表面标记，MSCs纯度比较高，具备更好的移植潜力。

因此77779193永利发现在此CellSeal无菌冷冻冻存管可作为一种MSCs细胞制剂临床用药包容器，本研究中冻存的ASCS在5% DMSO中以1000万细胞/毫升的浓度冷冻和解冻回收后显示出较高的功能活性，Cellseal在研究中涉及的冻存复苏流程可以在不需要洗涤细胞的情况下，以较小的DMSO残余剂量给药治疗细胞，并且通过进一步的FACS检测研究检测解冻后ASC较好的体内移植潜力。

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