发布时间：2022/07/15 点击数：胰岛移植为Ⅰ型糖尿病患者提供了一种特异性微创治疗方法，帮助患者有效的恢复正常血糖和摆脱胰岛素依赖。一般而言胰岛移植的临床适用性受到胰岛复杂解离过程的限制，特别是胰岛产量的提高是胰岛移植成功率提高的关键。据相关文献（文献1）证明胰岛解离用的胶原酶是影响胰岛产量的一个关键因素，可能会影响胰岛的临床结果。
市面上也有高度纯化的胶原酶产品，曾并被发现解离胰腺组织非常有效，但这些胶原酶是一般使用牛的神经组织和其他特定风险材料制造的，存在牛海绵状脑病的潜在传播风险，因而关于胰岛移植的临床应用被限制。现在被众多国际糖尿病治疗研究的临床中心使用的是一种GMP级胶原酶(胶原酶NB1)和GMP中性蛋白酶(中性蛋白酶NB)组合的胰岛移植胶原酶方案。该组合胶原酶方案不含牛神经组织污染物或其他指定的风险原材料物质，且大量数据文献分析已证明，该产品的活性与市面其他非临床适用的胶原酶产品相似，从而从解离功能和安全性上都符合临床级胰岛移植的应用。
本次小编分享的是加州大学旧金山分校的研究者们利用这种胶原酶组合进行胰岛解离获得适合移植的高质量胰岛的实验过程和结果。
图1 本次研究得到了美国青少年糖尿病研究基金会和美国国立卫生研究院资助
1、胰腺捐赠者筛选
一直以来胰腺组织的供体大小是一个重要的考虑因素，根据已有经验研究者筛选来自于体重超过90公斤、身高超过180厘米的男性捐赠者的胰腺组织。此外如表1所示Nordmark（Serva）组合酶的胰岛解离方案针对的捐赠者的年龄阶段（＜45岁）相对市面上其他胶原酶产品（小于32岁）更为宽泛（表1），这可能与Nordmark组合酶中使用中性蛋白酶代替嗜热菌蛋白酶以及相对较低水平的类胰蛋白酶活性有关（文献2）。
表1 两组胶原酶对比实验中用于胰岛移植的捐赠者的特征
2、胰腺组织消化实验
图 2 Ricordi Chamber以及其中初步解离的胰岛样本
所有用于临床胰岛移植的胰腺都由研究者自己的移植研究员从实体器官移植官方已认证的胰腺采购渠道购买，胰腺组织在医院从人体切割下来立即浸泡在威斯康星大学保存液(UW液)中，随即送往胰岛处理实验室（符合联邦法规的GMP级设施）处理。处理过程时首先在胰管孔位置插管，利用压力传感器和泵以可控的方式操控胰腺扩张，然后将组织切成碎片，放入Ricordi Chamber（如图2左）。
胰腺消化过程主要包括为：消化溶液的温度在5分钟内提高到37°C，然后处理消化时间控制在15分钟之内。当2 mL的分装样本中出现超过40个胰岛时停止消化停止（图2右），同时有游离胰岛和内嵌的胰岛，腺泡组织大小小于300μm。停止消化的决定是由同一个人在每次消化期间做出的。消化时间和停止标准与同组的其他胶原酶一致。用室温RPMI冲洗Chamber将温度降至30℃即可停止消化。消化物被迅速收集到含有冷RPMI、人血清白蛋白、胰岛素和肝素的烧瓶中，然后离心。然后将上述组织微球混合物在含有2%五聚淀粉、人血清白蛋白肝素和血清胰岛素的冷藏溶液中。淀粉的使用是因为它优先进入胰腺腺泡组织并改变其密度，从而更有利于胰岛分离。
利用梯度isopyknic iodixanol（异磷碘二醇）在Cobe 2991细胞分离器上分离胰岛，对于组织体积超过25 mL，可使用Cobe袋解离处理。分别收集胰岛纯度>80%、50-80%和30-50%的组分进行洗涤，然后放入添加了0.025%的人血清白蛋白CMRL 1066的组织培养摇瓶中在37°C下培养12-24小时，在22°C下再培养24-48小时。然后移植前，清洗胰岛并悬浮在200 mL室温移植培养基中辅以肝素添加，移植待用。
3、解离效果
最终整个胰岛解离的实验发现1600U胶原酶&200U中性蛋白酶在总体积为350毫升的消化体系中处理100克胰腺产生最佳的胰腺消化效果以及最高的胰岛产量。如文献表2种所示，这样组合酶的使用量低于该研究中其他胶原酶的用量，而且本次研究中获得的组合酶的标准化浓度从大多数捐赠者的胰腺组织解离应用中产生了相对最好的胰岛产量。研究者还评估了不同批次的胶原酶酶，以确定不同批次之间是否存在显著的差异性。14个临床胰岛移植手术使用了4个不同批次的胶原酶NB1和4个不同批次的中性蛋白酶NP1，所有的批次都产生了相似的消化时间、胰岛产量、活力、培养存活率和移植后功能。在实验室有限的小范围批次系列实验表明，该组合酶的批次是相对一致的，但因为胶原酶批次间差异性仍然是胰岛移植的一个重要关键所在，需要后期进行更大规模的研究来充分评估这一因素。
表2 应用两种不同胰岛解离的胶原酶方案的临床比较
组合酶解离胰岛相对其他单一酶产品的优势是因为中性蛋白酶与胶原酶的活性比值对于成功的胰岛分离至关重要，可以灵活的根据被处理的胰腺个体特征（如年龄和器官的差异性等捐赠者的特征差异）来调整胶原酶和中性蛋白酶的比例获得最佳解离效果，Bucher及其同事提出优化中性蛋白酶与胶原酶的活性比率对于自体移植胰岛的分离至关重要，例如纤维化胰腺可能受益于更高比例的中性蛋白酶（文献3）。此外组合酶中的这种单个酶组分的分开存储也提高了工作时每种酶的活性发挥的稳定性（文献1）。
图3 Nordmark 无动物源AF-1 GMP级胶原酶
胰岛解离方案的组合胶原酶产品级别包括科研级和GMP两种级别（图3和图4），这两个级别具有相似的成分和活性，区别是后者根据欧盟GMP指南生产，并被制造商推荐可用于临床胰岛移植。为了符合胰岛设施的cGMP法规和CIT的要求，本次研究只使用了GMP级组合胶原酶。
图4 Nordmark 科研优质级NB1胶原酶
德国 Nordmark 公司全球知名的胶原酶生产商，具备超过30年的高质量胶原酶专业供应，按照制药级标准进行纯化和生产，按照不同种属、组织/器官、细胞类型进行分类为组织细胞解离的提供整体解决方案（图5），包括从科研级到无动物源GMP级别多重选择，且相关GMP产品已在FDA备案DMF。满足用户绝大多数组织/器官的单细胞解离需求，包括提供敏感细胞解离专用的温和解离酶方案；使用简单，提供优化过的细胞解离Protocol和 各类应用的大量文献支持。
图5 Nordmark 胶原酶NB系列产品-从科研到GMP级的全线组织细胞解离方案
文中提到的Serva公司是Nordmark 曾在 2002 年合作的营销供应商，但是自2018 年，Nordmark 为更好地服务于细胞治疗与再生医学领域客户，改由全球范围内Nordmark自主营销 Collagenase NB 产品,且在中国授权上海77779193永利作为其中国合作伙伴，代理和营销Nordmark全线胶原酶产品（图6）。
图6 77779193永利-Nordmark中国区一级代理商
参考文献
1. Kin T, Johnson PR, Shapiro AM, Lakey JR. Factors influencing the collagenase digestion phase of human islet isolation. Transplantation 2007; 83: 7-12.
2. Brandhorst H, Friberg A, Andersson HH, Felldin M, Foss A, Salmela K, Lundgren T, Tibell A, Tufveson G, Korsgren O, Brandhorst D. The importance of tryptic-like activity in purified enzyme blends for efficient islet isolation. Transplantation 2009;87(3):370-5. [PubMed: 19202441]
3. Bucher P, Mathe Z, Morel P et al. Assessment of a novel two component enzyme preparation for human islet isolation and transplantation. Transplantation 2005; 79: 91–97.
