发布时间：2023/01/13 点击数：近年来，CAR-T/NK细胞免疫疗法在实体瘤治疗研究领域中非常火热。随着细胞免疫治疗的兴起也推动了实体瘤研究的发展，但是由于人源化体系的复杂性、免疫系统的部分或无效重组建等问题，致使免疫肿瘤模型面临着巨大的挑战，临床上迫切需要能够用于个体化验证疗效的体外模型。细胞微球为细胞免疫治疗在实体瘤中的研究提供了新的契机。然而，现有的细胞微球培养方法中有许多限制因素阻碍了肿瘤细胞微球与免疫细胞充分接触。
InSphero 3D微球培养板为获得大小均一的肿瘤细胞微球提供了新的解决方案，同时为细胞微球与免疫细胞共培养提供一种新的选择。本文中小编将为大家分享一篇肿瘤细胞微球与免疫细胞共培养的解决方案。
肺肿瘤细胞微球与PBMC细胞免疫共培养解决方案
01- 试剂耗材
• 冻存的A549–GFP/hDF细胞
• 适宜的细胞培养基
• T75细胞培养瓶（Greiner，658175）
• InSphero Akura 96/384 Spheroid Microplate
• 无菌PBS缓冲液（无钙镁离子）
• 胰酶
• 70%乙醇
• 血球计数板
• 水浴锅（设置在37℃）
• 血清移液管（5ml和10ml）
• 离心机
• 一级生物安全柜
• 二氧化碳培养箱（设置在5% CO2浓度和37℃）
• 倒置显微镜
• 15ml无菌离心管
• 多通道移液器、适配的无菌吸头、无菌试剂槽
02- 细胞扩增
注意：所有实验步骤遵照无菌操作规范在生物安全柜中操作。
1、确保所有细胞培养基标记清晰并在正确的条件下存放。
2、将培养基预热至37℃。
3、向T75中加入5ml预热的培养基。
4、在水浴锅中快速融化细胞。
5、使用血清移液管吸取5ml预热的培养基，并于融化的细胞混合，将混匀液转移至15ml离心管中。
6、室温下离心，200 RCF 2min，弃去上清液，并用5ml预热培养基重悬细胞。
7、将细胞转移至T75中。
8、将T75转移至二氧化碳培养箱中。
9、培养24h后，更换培养基，并在显微镜下检查细胞贴附情况。
10、当细胞达到70-80%交汇度时（约48h）可以用于下游的细胞微球培养。
03- 细胞悬液制备
1. 将培养基预热至37℃。
2. 将T75从二氧化碳培养箱中取出，使用血清移液管弃去培养基。
3. 向T75中加入10ml的PBS。
4. 轻轻摇晃培养瓶后弃去PBS。
5. 加入1ml的胰酶（1x），于37℃孵育5min。
6. 加入9ml的完全培养基（含FBS）终止消化。
7. 将细胞液转移至15ml离心管。
8. 室温下离心，200 RCF 2min，弃去上清液，并用适量（取决于细胞压积）预热培养基重悬细胞。
9. 使用血球计数器（或其他细胞技术方法）进行计数。
10. 调整细胞密度至12500cells/ml（即500 cells/40μl）。
04- 细胞微球构建及培养（图1）
图1 Akura 96孔微球培养板的使用流程
1、使用70%乙醇擦拭Akura培养板的外包装，并在生物安全柜中取出Akura培养板。
2、将单细胞悬液转移至试剂槽中，使用移液器轻轻吹打细胞悬液以保证浓度均一。
3、使用多通道移液器或自动化工作站将细胞种植至Akura培养板，每孔70μl。
4、盖上板盖，室温下离心，250 RCF 2min。
5、将培养板转移至湿润的二氧化碳培养箱中，并保持斜立（与水平面夹角30度，图1）。此过程可以使用InSphero专门设计的Akura斜立支架（图2，InSphero，CS-10-002-00）或将培养板的一侧垫高。
图2 Akura斜立支架（InSphero，CS-10-002-00）
05- 细胞微球与PBMC共培养
1. 用初始直径约为250µm的A549-GFP/hDF细胞微球与免疫细胞进行共培养。
2. PBMC细胞按照制造商说明书进行复苏；
3. PBMC用anti-CD3（5ng/ml）和anti-CD28（250ng/ml）预处理24h；或不做处理（T-cell-naïve）。
4. 抗体预孵育的PBMC使用A549–GFP/hDF完全培养基洗涤3次；
5. PBMC在A549–GFP/hDF完全培养基中稳定培养24h；
6. PBMC用10 µg/mL的CellTracker Deep Red dye（cat. no. C34565）在37℃条件下染色1h；
7. A549–GFP/hDF细胞微球与PBMC在insphero 384微球培养板中共培养（10:1 E:T rate）；
8. 使用3D活细胞成像设置监测肿瘤微组织内的免疫细胞的浸润39小时。
06- 结果
肺癌细胞肿瘤微球与免疫细胞共培养的活细胞成像结果如图3所示，其中红色为免疫细胞；绿色为A549-GFP/hDF细胞；该研究中对No PBMCs、naïve PBMCs、Activated PBMCs三个实验组分别选取0、4h和37h三个时间点进行分析。结果表明Activated PBMCs在37h时可以有效杀死A549肿瘤微球中的细胞。
图3 3D肺癌模型中免疫细胞浸润的活细胞成像
07- 结论
InSphero微球培养板是为3D细胞模型的常规生成和长期培养而设计的。超低吸附材质制备的孔底可以确保细胞微球在生长过程中不会粘附在板底部。Insphero微球培养板在进行细胞微球培养时，通过在每个孔中接种相同数量的肿瘤细胞，可以为免疫细胞共培养提供良好一致性的细胞微球。此外，Insphero微球培养板特殊的孔结构为细胞微球和免疫细胞提供了更加拥挤的微环境，使免疫细胞与肿瘤细胞充分接触以达到较好的杀伤效果。
参考文献
[1] Wardwell-Swanson J,Suzuki M,Dowell K G,et al. A Framework for Optimizing High-Content Imaging of 3D Models for Drug Discovery:[J]. SLAS Discovery,2020,25(7):709-722.
