发布时间：2022/11/09 点击数：一、简介
InSphero Akura PLUS 悬滴培养系统包含Akura PLUS Hanging Drop Plate (“PLUS Plate”) （图1左）和Akura 96 Spheroid Microplate（图1右）两个组件。PLUS Plate中形成的悬滴有助于增殖较慢或成球困难的细胞的3D细胞模型的构建和测试。当在显微镜下观察到细胞形成微球之后即可将细胞微球转移至96微球培养板中继续培养并进行测试实验。微球培养板独特的SureXchange换液平台可以简便地实现更温和、更彻底的培养基交换。Akura系列培养板中产生的细胞微球大小均匀，适用于开展高通量、高重复、高可靠性的测试实验，并能广泛兼容多种终点分析和生化分析以及大多数高分辨率的细胞成像应用。
图1 InSphero Akura PLUS 悬滴培养系统结构示意图
二、HCT116的细胞3D模型构建
以下实验方案描述了使用InSphero Akura PLUS 悬滴培养系统生成3D肿瘤微球的实验方法，旨在为成功开展实验提供详细的指导，并提高首次使用产品的体验。本方案包括了培养板的准备、单细胞悬液的制备、细胞悬滴制备、细胞悬滴转移、换液操作以及建议的质量控制步骤。
01、实验材料
• 冻存的HCT-116细胞（人结肠癌细胞系：ATCC，CCL-247）
• 适宜的细胞培养基
• T75细胞培养瓶（Greiner，658175）
• InSphero Akura PLUS Hanging Drop System
• 无菌PBS缓冲液（无钙镁离子）（Sigma-Aldrich，D1408）
• 胰酶
• 70%乙醇
• 血球计数板
• 水浴锅（设置在37℃）
• 血清移液管（5ml和10ml）
• 离心机
• 一级生物安全柜
• 二氧化碳培养箱（设置在5% CO2浓度和37℃）
• 倒置显微镜
• 15ml无菌离心管
• 多通道移液器、适配的无菌吸头、无菌试剂槽
02、HCT-116细胞的扩增
注意：所有实验步骤遵照无菌操作规范在生物安全柜中操作。
1. 确保所有细胞培养基标记清晰并在正确的条件下存放。
2. 将培养基预热至37℃。
3. 向T75中加入5ml预热的培养基。
4. 在水浴锅中快速融化细胞。
5. 使用血清移液管吸取5ml预热的培养基，并于融化的细胞混合，将混匀液转移至15ml离心管中。
6. 室温下离心，200 RCF 2min，弃去上清液，并用5ml预热培养基重悬细胞。
7. 将细胞转移至T75中。
8. 将T75转移至二氧化碳培养箱中。
9. 培养24h后，更换培养基，并在显微镜下检查细胞贴附情况。
10. 当细胞达到70-80%交汇度时（约48h）可以用于下游的细胞微球培养。
03、制备单细胞悬液
1. 将培养基预热至37℃。
2. 将T75从二氧化碳培养箱中取出，使用血清移液管弃去培养基。
3. 向T75中加入10ml的PBS。
4. 轻轻摇晃培养瓶后弃去PBS。
5. 加入1ml的胰酶（1x），于37℃孵育5min。
6. 加入9ml的完全培养基（含FBS）终止消化。
7. 将细胞液转移至15ml离心管。
8. 室温下离心，200 RCF 2min，弃去上清液，并用适量（取决于细胞压积）预热培养基重悬细胞。
9. 使用血球计数器（或其他细胞技术方法）进行计数。
10. 调整细胞密度至12500cells/ml（即500 cells/40μl）。
04、3D细胞模型的构建-悬滴形成
1. 拆开包装之前，用70%乙醇擦拭Akura PLUS板袋；
2. 无菌条件下打开袋子，取出Akura PLUS板；
3. 向直径15cm的培养基中加入20ml 浓度为0.5% 的PBS溶液，将加湿垫放入0.5%PBS中浸湿（约5min）。
4. 将加湿垫放入到加湿槽中，并加入12ml的0.5% PBS。
5. 每孔加入40ul细胞悬液（图2左）；轻微施加压力使确保吸头尖端与PLUS板孔入口紧密接触（图2右），以确保液体完全转移和保证悬滴的均一性。
图2 在Akura PLUS板中制备悬滴
6. Akura PLUS板放置在5% CO2，37℃恒温孵育箱中培养。
注意：请小心移动Akura PLUS板，以避免悬滴滴落。
7. 通过加湿垫的切口定期评估球状体的形成情况。图3a，3b，3c分别展示了细胞接种30min，1d和3d时球状体的生长状态。大约4天后，大多数细胞都能在悬滴中形成细胞微球。
图3 不同时间点球状体的形成情况
05、细胞微球转移
为了长期培养和实验分析，需要把悬滴从Akura PLUS板中转移至Akura 96孔微球培养板中进行培养。
• Akura 96 Spheroid Microplate预湿润
注意事项：在使用前对Akura 384孔微球培养板进行预湿润操作，可以有效避免孔内气泡的产生。
以下操作均在无菌环境下进行：
① 将40ul含FCS或BSA的细胞系培养基小心加入到insphero 384微球培养板的每个孔中，注意吸头尖端不要触及到孔的底部。
② 轻轻上下移液孔中的介质（该过程需避免产生气泡）。
③ 缓慢移除介质。
• 细胞微球转移
① 利于设计的栓孔结构（图4）将Akura PLUS板放置在Akura 96孔微球培养板上，此时Akura PLUS板上的悬滴将会与Akura 96孔微球培养板上的孔完全对应。
图4 InSphero 96孔微球培养板栓孔结构
Note：绿色箭头所指的是微球培养板的Akura PLUS板精确结合的固定孔，Akura PLUS板上设有位置对应的栓结构。
② 通过Akura PLUS板的孔入口缓慢加入70ul完全培养基（≤10ul/sec），吸头尖端与孔的入口接触并施加轻微压力，将悬滴转移到Akura 96孔微球培养板中（如图5）。
③ 通过导致显微镜观察来验证微球转移。
④ 微球转移后，将Akura 96孔微球培养板放置在微孔板离心机中，在250rcf条件下离心2min，是细胞微球沉降到孔的底部，并清除气泡。
⑤ 为了确保每个孔中培养基的体积的准确性，可以先将孔的培养基去除，并重新加入70ul新鲜培养基。
图5 细胞微球Akura PLUS板转移至Akura 96微球培养板
⑥将Akura 96微球培养板放入5%CO2,37℃恒温培养箱中继续培养。
06、培养基更换
InSphero Akura 96微球培养板独特的孔结构可以实现高效、便捷的换液操作，同时可以有效避免微球损失和微球丢失。培养基更换流程如图6所示。
① 将吸头尖端放置在孔边缘的平台上，以≤30ul/sec的移液速度缓慢吸出孔中的培养基；孔中将会有5-7ul的培养基残留；
② 将吸头尖端放在孔边缘的平台上，以≤50ul/sec的移液速度缓慢加入新鲜培养基。
③ 将Akura 96微球培养板放入5%CO2，37℃恒温培养箱中继续培养。
图6 Akura 96微球培养板培养基换液流程
说明：本文内容仅介绍InSphero Akura PLUS悬滴培养系统在进行3D细胞模型构建应用中操作过程的介绍，不包含结果分析。对结果分析感兴趣的读者可以参考以下资源和文章：
1、P. Beauchamp, et al., Development and Characterization of a Scaffold-Free 3D Spheroid Model of Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Human Cardiomyocytes, Tissue Eng., Part C, 2015, 21(8), 852–861
