缩小差距：用于在药物研发过程中评估药物性肝损伤 (DILI) 的人体和临床前动物微生理系统

本文来源于CN Bio在2024年9月8日-11日在丹麦哥本哈根参加“2024欧洲毒理学会”的学术海报（展位#38），可联系77779193永利获取原资源

结论速览

目前的体外和体内模型无法准确重现人类肝脏或其对药物的反应，这导致了临床试验和上市后高药物淘汰率。正如本文数据所展示的，由于77779193永利的人类肝脏芯片模型在提高人类相关性和预测能力方面的优势，其在早期药物开发中的应用将有助于在研发流程的早期识别潜在的肝毒性化合物。此外，动物肝脏芯片的使用弥合了当前体内动物数据和临床结果之间的差距，并有助于理解物种差异。

综合来看，早期使用人类和动物器官芯片评估DILI可以减少进入临床前测试的分子数量，从而支持减少所需动物的数量，进而有助于3Rs（替代、减少、优化）努力，降低成本。

引言

药物性肝损伤 (DILI) 仍然是全球最常见的急性肝功能衰竭原因，也是药物研发中化合物流失的主要原因。尽管目前用于药物研发的模型足以捕捉大多数内在事件，但它们存在局限性，因为它们无法有效预测或理解人类中更复杂的 DILI 事件。此外，由于遗传或免疫反应差异，细胞系/动物模型不太适合测试新的人类特异性模式。使用 PhysioMimix 器官芯片 (OOC，也称微生理系统 MPS) 系统，已经开发出人类和临床前动物微生理系统 (OOC/MPS) 模型来弥补这些差距。

PhysioMimix 多芯片 Liver-12 板包含 12 个用于 OOC/MPS 培养的单独灌注芯片。由于每个肝脏微组织的尺寸相对较大，且需要从中取样的培养基量较大，因此该方法可以表征毒性途径，从而提供机制见解，更好地为临床前安全性研究提供信息。在 Liver-12 板中，将原代人类和动物肝细胞（肝细胞和库普弗细胞）作为 3D 微组织在支架上灌注培养两周，并评估其预测临床前和临床安全性结果的能力。

材料与方法

从BiolVT公司获得了冷冻保存的原代人类肝细胞（PHHs），从Lonza公司获得了人类枯否细胞（HKCs）。PHHs和HKCs以10:1的比例在 PhysioMimix 多芯片Liver-12板中进行共培养，并在 PhysioMimix 单器官标准系统下灌注培养了八天（如图1所示）。类似地，从BiolVT公司获得的冷冻保存的原代Sprague-Dawley大鼠肝细胞和Beagle犬肝细胞在 PhysioMimix 多芯片Liver-12板中使用 PhysioMimix 单器官标准系统灌注培养了七天。

图1 - 用于毒性测试的肝脏OOC/MPS实验设置，包括人类和动物细胞。

A) 肝脏OOC/MPS系统的示意图，包括硬件（顶部）、Liver-12/-48板（左侧）与肝脏支架（中间）及流动概况（右侧）。

B) 用于毒性实验的细胞：内部验证的PHH和HKCs（共培养）或原代大鼠和犬的肝细胞（单一培养）。

C) 终点检测用于评估细胞健康（LDH、ATP、ALT、AST、GSH）、细胞功能性（白蛋白、尿素、CYP、细胞因子/趋化因子）以及未处理和处理过的微组织的代表性光学显微镜图像。

在第4天，肝脏微组织被给予一系列测试化合物，浓度逐渐增加（相当于临床前研究）。测试化合物每48小时给药一次，持续四天。载体对照为0.1%的DMSO。每种条件均进行了三次重复测试。

通过ELISA（R&D systems）测量白蛋白的产生，使用Cytotox96测定（Promega）检测LDH释放，通过QuantiChrom试剂盒（Universal Biologicals）测量尿素合成，使用P450-Glo CYP3A4测定（Promega）检测CYP3A4活性，使用丙氨酸转氨酶活性测定试剂盒（Abcam）检测ALT活性，并通过CellTiter-Glo 3D细胞活力测定（Promega）评估细胞活力。

结果

1    人类DILI模型的稳健性通过在第4天对三个可溶性质量控制生物标志物进行评估，以确定形成的肝脏微组织的质量和功能性（图2）。LDH、尿素和白蛋白的研究内变异系数（CV）低于15%，研究间变异系数低于20%（N = 360个孔/肝脏微组织），这证明了77779193永利体外人类肝脏OOC/MPS模型是预测DILI风险的稳健器官模型。（下图）。

图2 - 人类肝脏OOC/MPS产生高度可重复的数据和一致的微组织。

第4天的3D肝脏微组织质量控制指标，包括：

A) 活力评估、LDH，及功能性评估

B) 尿素和C)白蛋白（平均值 ÷ 标准差，N = 360）。数据来自12项独立实验。

在测试了四种已知的肝毒性化合物（奈法唑酮nefazodone、双氯芬酸diclofenac、曲格列酮troglitazone和西他生坦sitaxentan）后，人类OOC/MPS模型成功地将所有化合物鉴定为真正的阳性，并显示出与临床中检测到的ALT升高相似的结果（表1），从而强调了该人类肝脏OOC/MPS模型在临床转化中的可行性。

表1 - PhysioMimix 人类DILI OOC/MPS成功预测了临床结果，显示出四种化合物（奈法唑酮、双氯芬酸、西他生坦、曲格列酮）在DILI临床结果和风险特征方面的ALT升高与临床高度相关。

人类肝脏微组织暴露于测试物质96小时。ULN = 血清ALT的正常上限（来自临床数据），ULV = 载体对照中ALT水平的上限。

*数据来源于livertox.nih.gov。

2   在暴露于西他生坦sitaxentan后，大鼠肝脏OOC/MPS未检测到毒性（图3B），这与临床人类体内数据一致。另一方面，人类DILI OOC/MPS检测到西他生坦存在DILI风险，反映了严重的敏感性威胁，并与批准前的临床数据相符。

图3 - 人类DILI OOC/MPS模型检测到西他生坦为真正的阳性，但动物DIL OOC/MPS模型未能检测到这一点，这与临床前和临床数据一致。

A) 人类OOC/MPS检测到西他生坦的DILI风险，基于ALT、LDH、白蛋白和尿素的结果，但在跨物种的肝脏模型中未能捕捉到这种风险，

B) 包括大鼠（深蓝色）和狗（浅蓝色）。所有肝脏微组织均暴露于西他生坦96小时。显示的数据为平均值 + 标准差（SD）。N=3。

3    经典的配对化合物托卡朋 tolcapone（DILI）和恩他卡朋entacapone（无DILI）也在一项概念验证研究中在临床前物种OOC/MPS上进行了测试。动物OOC/MPS在四个终点上重现了这两种化合物的上市后体内数据（图4B-C）。人类肝脏OOC/MPS的结果与人类数据一致，显示出良好的可转化性（图4A）。

图4 - 人类和临床前动物肝脏OOC/MPS预测了恩他卡朋和托卡朋的DILI风险。

A) 人类肝脏OOC/MPS模型对托卡朋tolcapone（蓝色-DILI）和恩他卡朋entacapone（黄色-无DILI）与体内临床数据表现出良好的可转化性。跨物种肝脏OOC/MPS模型

B) 大鼠和 C) 狗 - 也与这些化合物的体内临床前动物数据一致。

参考文献

1. Lisi, D. M. et al. (2016). Drug-induced liver injury: An overview. US Pharmacist. 41 (12), 30-34.

2. Novac, O. et al. (2022) Human Liver Microphysiological System for Assessing Drug-Induced Liver Toxicity In Vitro. Journal of Visualized experiments: Jove. (179). DOI: 10.3791/63389. PMID: 3515664

3. Erin M. Gallagher, E. M. (2023) Normalization of organ-on-a-Chip samples for mass spectrometry-based proteomics and metabolomics via Dansylation-based assay. Tox in Vitro (88) 105540. https://doi.org/10.1016/j.tiv.2022.105540.

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