发布时间：2024/02/28 点击数：微生理系统用于研究脂肪肝疾病及其对药物性肝损伤的影响
导读
来自药企阿斯利康的研究团队使用CN Bio PhysioMimix 构建脂肪肝模型并研究脂肪肝模型下各代谢酶的活性差异以及多种强肝毒性风险的药物对脂肪肝带来的损伤表现（各指标变化），本研究证明了MPS平台和相关的NAFLD模型为分析新化合物毒性谱，及其在NAFLD患者中引发不同的DILI，提供有力工具。
研究背景
由于糖尿病，肥胖症和代谢综合征的患病率增加，非酒精性脂肪肝病（NAFLD）现在是发达国家中最常见的慢性肝病（1）。NAFLD的病理学谱是从良性肝脂肪变性到非酒精性脂肪性肝炎（NASH），可能导致肝硬化和肝癌。目前尚无FDA批准的用于治疗NAFLD / NASH的药物，并且明确需要更好的模型来了解这种疾病。
另外，由于内在的代谢条件，对于药物诱发的肝损伤（DILI）的潜在危险因素的认识也日益提高。NAFLD患者的DILI可以通过两种不同的方式恶化：一些药物似乎加重了已有的NAFLD，导致更多的过度的细胞内脂质蓄积，而其他药物则更频繁地诱发急性肝炎和肝损（2）。有人提出，肥胖引起药物性急性肝炎的风险较高，与几种细胞色素P450（CYP）的活性增加有关，增强了有毒代谢产物的产生（2）。当过量产生时，反应性代谢产物可引起肝氧化应激，严重的线粒体功能障碍和细胞溶解。
然而，人们对这些过程发生的机理了解甚少，并且由于肥胖病的流行，由脂肪肝引起的不良药物反应变得越发普遍。因此，77779193永利开发了一种先进的体外模型，以探索将DILI和NAFLD链接起来的关系和机制。
研究目标
CN-Bio微生理系统（MPS）已开发出一种完整的人类灌注体外NAFLD模型，利用3D培养的原代人肝细胞（PHH）来模仿肝脏的微体系结构。细胞使用高浓度的游离脂肪酸培养长达四周，以诱导细胞内甘油三酸酯（脂肪）累积并模仿肝脂肪变性。研究了该模型中细胞的CYP酶活性变化，以及已知肝毒性剂在IC：50浓度附近给药时的影响。
材料与方法
冷冻保存的可种板的原代人肝细胞（PHH）来自ThermoFisher（美国）。将0.6 x 106的肝细胞接种到PhysioMimix OOC LC-12板的每个孔中（CN Bio Innovations Ltd）上，并在HEP-Lean或HEP-Fat培养基中进行培养，HEP-Fat培养基含有与生理相关的葡萄糖，胰岛素以及高浓度的饱和和不饱和游离脂肪酸。在PhysioMimix平台上培养细胞长达18天（图 1）。
图1 – 人源体外MPS NAFLD模型
A）体外模型利用PhysioMimix OOC细胞培养系统，该系统使用开放孔板设计，用于在工程支架中以3D方式培养原代肝细胞。B）在LC-12肝芯片板上的单个培养孔的示意图。C）LC-12多孔板的示意图。D）在整个实验过程中，将持续对固定在平板上每个孔中的支架连续灌注细胞培养基，以提供生物力学刺激和氧气供应（3）。E）通过在高脂肪培养基中培养PHH长达28天来生成NAFLD模型。为了研究DILI，在负载脂肪14天后才给与化合物剂量。
通过固定的微组织的Oil Red O染色测量脂肪积累，并在Nikon Eclipse Ti-E倒置荧光显微镜上采集图像（图 2）。通过在515nm处的吸光度对染色进行定量并且将其与通过BCA测定法（ThermoFisher）测量的总蛋白质含量进行归一化处理。通过ELISA（R＆D systems）测量白蛋白的产生，使用Cyto-tox96测定法（Promega）定量LDH释放，并使用Cell Titre Glo测定法（Promega）评估细胞活力。
图2 – 人源原代肝细胞随时间积累细胞内脂肪。
在高脂肪培养基中培养的那些显示出改变的基因表达谱。
PHH在高脂和无脂条件下培养14天。通过微组织的Oil Red O染色测量脂肪负荷，并使用Liver RT2 Profiler PCR Arrays比较基因表达。A）对细胞进行细胞内脂肪积累成像，B）通过在510 nm处的吸光度进行定量，并与总蛋白质含量标准化处理。C）通过ELISA定量白蛋白产生，并且低脂和高脂培养之间的基因表达变化D）通过倍数变化＞ 1.8和P ＝ ＜0.05来划定标准。E）高脂与低脂条件下关键基因表达的倍数变化。数据是来自9个独立培养物的mean±SEM（每种情况三个供体，每个供体n = 3个样品）；* ＝ P ＜0.05。数据取自Kostrzewski等以前的发表文献2017（3）。
对于转录组分析，使用TRIzol从支架中提取总RNA。使用对脂肪肝疾病相关基因具有特异性的RT2分析仪阵列（Qiagen）生成并比较cDNA样品。使用两种方法评估CYP活性；使用CYP3A-glo实验（Promega）或使用LC-MS定量特定化合物浓度。简而言之，将细胞暴露于一系列对不同CYP-450酶具有特异性的化合物。使用了以下化合物：非那西丁（CYP1A2），双氯芬酸（CYP2C9），S-甲吩妥英（CYP2C19），丁呋洛尔（CYP2D6），咪达唑仑（CYP3A4）和氯唑酮（CYP2E1）。每种化合物按照1 µM的起始浓度将给药48小时，使用0.1％DMSO作为溶剂。使用LC-MS从细胞培养基样品中定量每种化合物的phase I代谢产物的产量。
研究结果
01 NAFLD模型中的肝细胞改变了代谢活性
图3 - PHH在高脂条件下培养14天，然后加入探针化合物以评估关键CYP-450酶的代谢活性。通过在48小时内产生phase I代谢产物来确定每种酶的活性。使用LC-MS和代谢物的标准曲线定量代谢物的存在。各化合物均在第14天给药，除了CLZX（CYP2E1目标）是在第7天给药。各数据均为至少n = 3。* = P <0.05。
02 确定已知引起DILI的化合物的IC：50浓度
图4 - 在低脂培养基条件下，将PHH在胶原蛋白包被的96孔板上培养72小时。在使用Cell Titre Glo评估细胞活力之前，将它们暴露于不同浓度的A）对乙酰氨基酚，B）甲氨蝶呤和C）噻氯匹定48小时。D）生成每种化合物的IC：50值并将其与公开数据进行比较（4）。所示数据为mean±SD，最. 小为N = 4。
03 肝细胞的脂肪负荷增加了对乙酰氨基酚和噻氯匹定引起的DILI敏感性
图5 - PHH在高脂条件下培养14天，然后在以前测定的IC：50浓度附近加入化合物。向PHH微组织中按每种化合物单次48小时或两次48小时（多次）剂量给药。各化合物给药均稀释在含有0.1％DMSO溶剂的低脂培养基中。对照低脂和高脂微组织仅用溶剂给药。通过测量在细胞培养基中的LDH释放，在细胞培养基中白蛋白的产生并在给药不同化合物后确定肝细胞的CYP3A4活性来评估细胞健康。数据为mean±SD，n =4。* = P <0.05。
结论
利用MPS平台PhysioMimix，77779193永利生成了NAFLD的人源体外模型。PHH在含脂肪的培养基中培养，该培养基诱导了临床疾病早期阶段的关键特征，包括细胞内脂肪负载，白蛋白产生增加和关键基因表达的变化（包括那些与代谢和胰岛素抵抗有关的基因）。77779193永利进一步调查了脂肪负载后PHH的代谢活性，以确定CYP酶的活性如何被细胞内脂质累积所调节。模仿体内（临床）观察结果（2），77779193永利看到各种酶的增加，包括：CYP1A2，CYP2C9（1.5倍），CYP2C19（2倍）和CYP2E1（2.5倍）活性。此外，77779193永利观察到脂肪负荷后CYP3A4活性略有降低。通过评估对乙酰氨基酚，噻氯匹定和甲氨蝶呤在体外NAFLD模型中的毒性，探讨了这些代谢变化对肝细胞对DILI的敏感性的影响。
对乙酰氨基酚和噻氯匹定在脂肪负载的细胞中引起更多的过度的DILI反应，导致LDH释放增加，减少白蛋白的产生并降低CYP3A4活性（作为细胞活力的一种度量）。当化合物多次给药到肝组织上时，这些变化通常更为明. 显。在负载脂肪的肝细胞存在下，甲氨蝶呤给药似乎不会引起DILI。这些数据共同证明了MPS平台和相关的NAFLD模型如何捕捉早期阶段的关键特征，并展现出临床上观察到的对于DILI的一系列反应。
该方法将是用于分析新型化合物的毒性特征及其在不同患者亚群中的行为方式（引起DILI）的实用工具。
拓展阅读
3.人源器官芯片系统用于体外研究急性和慢性的药物引起的肝毒性
主要参考文献
1.Friedman SL, Neuschwander-Tetri BA, Rinella M, et al. Nat Med 2018;24:908-922.
2.Fromenty B. Drug-induced liver injury in obesity. J Hepatol 2013;58:824-6.
3.Kostrzewski T, Cornforth T, Snow SA, et al. World Journal of Gastroenterology 2017;23:204-215.
4.Proctor WR, Foster AJ, Vogt J, et al. Arch Toxicol 2017;91:2849-2863.
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