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用于器官芯片预验证细胞的指南(下)| 独立进行您自己的验证
发布时间:2023/10/30 点击数:

本文概况

FDA 使用CN-Bio 的器官芯片系统(OOC) 探讨了毒理学终点的供体间变异性。另外,如何选择最适合的细胞组合来准确地代表给定的群体,是减少变异性的关键。


前言

尽管77779193永利鼓励客户尽可能使用77779193永利目录中经过验证的细胞(详见《用于器官芯片预验证细胞的指南(上)| 使用预先验证的细胞》(可点击文字跳转阅读)),但77779193永利了解某些地理区域的进口限制会影响这一点。而且,您可能希望从头开始开发自己的模型,拥有替代解决方案,甚至可能是内部开发的平台。


然而,人类本身表现出种内差异(例如,全球25%的人口患有脂肪肝),并且在选择供体之前必须仔细考虑供体的年龄、性别、种族以及环境暴露等因素,除了这种固有的基于人群的变异性之外,细胞供体间不同的细胞提取方法也会引入额外的变异性,此外还要对您选择的 OOC 平台与未来的使用环境(或应用程序)进行彻底的测试。


因此,在进行自己的内部预验证检测时需要考虑什么?接下来请看FDA如何开展细胞的预验证研究:


对乙酰氨基酚对 CN Bio Innovations 肝芯片中原代人类肝细胞(PHH)功能影响的表征

微生理学系统(MPS),包括 OOC,正在被评估用于模拟人体生理、人类和动物疾病,以及用于监管测试的能力。传统毒性测试使用动物模型来预测人体反应,然而,由于物种的差异,这些预测的准确性可能不一致。使用人体细胞的器官芯片系统(下图)可以最大限度地减少这些差异

A:CN Bio Innovations的肝脏 MPS 平台由 LC12 平板组成,平板与 MPS 驱动器相连,并装载到扩展底座上,扩展底座与一台PhysioMimix 控制器主机连接,主机可调节流量和预设参数。

B:LC12 平板由一个支架组成,原代人类肝细胞播种在支架上,并在微通道内形成3D微组织。培养基在支架和储层中循环,不断提供流动。


目的

众所周知,原代人类肝细胞(PHH)在药物代谢和药物诱导等方面存在个体差异。因此,77779193永利的目标是确定个体、平均个体以及混合供体/批次在基线表达和对已知肝毒素(对乙酰氨基酚,APAP)的毒性反应中的差异。


初步研究表明,不同捐献者的所有基线终点以及对 APAP 毒性作用的敏感性都存在差异。本研究在变异性、灵敏度和特异性以及功效分析中也观察到了这一点。


这些发现表明,需要进行更多的研究,以阐明在这些研究中应如何选择细胞群和细胞组合,从而准确地代表感兴趣的人群。


方法

1.四个单一供体批次和一个 5 供体集合批次,分别暴露于低剂量(1-2 mM)、中剂量(3-5 mM)或高剂量(10-13 mM)的对乙酰氨基酚(APAP)中长达 96 小时(下表)。

2.肝脏 MPS 与原代人类肝细胞 (PHH) 按 0.6x106 个细胞/孔的比例接种,剂量浓度随机分配,以尽量减少蒸发造成的边缘效应。

3.将肝脏 MPS 连续暴露于 APAP 4 天,在第 4 天(暴露于 APAP 之前)、第 5 天(暴露后 24 小时)、第 6 天(暴露后 48 小时)和第 8 天(暴露后 96 小时)收集培养基进行分析。

4.对培养基进行 Albumin, Urea, LDH, ALT, 和AST分析。

5.变异性根据每批次的平均标准偏差确定。灵敏度/特异性根据阳性结果的数量计算。根据终点的不同,阳性结果是指平均对照的 +/- 50% 的变化。

6.根据终点的不同,功效和样本量的计算基于检测到比对照组大或小50%的差异的能力。


结果

1、基线白蛋白分泌量和对 APAP 反应的差异,可能会影响不同批次结果的解释

图1


不同批次的白蛋白表达基线不同,对暴露于 APAP 的敏感性也不同。图1-A 和 1-D 的白蛋白起始浓度较高,而 1-B 和 1-C 的白蛋白起始浓度较低。批次 1(1-A)对接触 APAP 最敏感,因为低剂量最终会产生毒性,而批次 3(1-C)在实验期间最难存活。每个批次 2-3 个实验,每个实验每个条件 N=1-5 个。(*)= P<0.05


2、特定捐献者的检测结果可能会影响对毒性反应效果的解释

图2


各供体的 ALT(而非 LDH)持续升高。批次 1 的 LDH(2-A)和 ALT(2-B)均显示细胞大量死亡。然而,批次 2 的 LDH(2-C)未显示出明显的细胞死亡,但 ALT(2-D)却显示出细胞死亡。总体而言,第 2 批(2-C 和 D)的起始细胞死亡率确实高于第 1 批(2-A 和 B),这表明细胞存活率存在批次差异。每个批次 2-3 个实验,每个实验每个条件 N=1-5 个。(*)= P<0.05


3、平均个体供体结果可能会捕捉到大的效应,而较小的变化可能无法被检测到

图3


四个单一供体的平均数据显示在高剂量下有毒性,但在低剂量下失去了一些批次所见的敏感性。所有个体供体的标准化白蛋白在最高浓度下显示出毒性(3-A),但在低剂量下未能检测到批次1(1-A)所示的毒性。尿素(3-B)在最高的APAP剂量下显示出降低,但由于批次效应差异,在最后一天并未显示出降低。LDH(3-C)由于LDH释放的批次差异,并未在最高的APAP剂量下显示出增加。尽管批次之间存在变异,但ALT(3-D)在合并批次中强烈增加。(合并4个单一供体批次,每个批次进行2-3次实验,每个实验每种条件使用1-5个芯片。N=23-29。)(*)=p<0.05


4、混合肝细胞(5 供体混合)没有表达高水平的白蛋白

图4


混合供体显示出非常低的白蛋白产量,少于1 μg/d/million cells,仍然观察到剂量反应。(2次实验,每次实验每种条件使用1-2个芯片,总计N=3-4。)(*)= p<0.05


5、芯片间(Chip-Chip)和实验间(Exp-Exp)的变异性在批次内是相似的,但在不同批次之间存在差异

表格1


表格1:变异性是通过计算所有天数中对照组(Chip-Chip,Exp-Exp)的平均标准偏差来计算的。Chip-Chip表示实验内芯片之间的变异性,Exp-Exp表示不同实验之间芯片之间的变异性。


6、敏感性和特异性也取决于批次和检测方法

表格2


表格2:敏感性是表现出积极效应(与对照相比变化在+/- 50%以内)的芯片的百分比,特异性是在平均对照的50%以内的芯片的百分比。某些批次和检测方法比其他批次和方法更敏感。C=对照,L=低APAP,M=中APAP,H=高APAP。


7、功效和样本量因批次而异

表格3


表格3:77779193永利根据对照组的平均标准差进行了统计功效分析和样本大小计算,以便在 90% 的功效和 5% 的 I 类错误率条件下检测出与对照组相比 +/-50% 的变化。因此,功效表示生成数据的强度,而样本量则是检测到与对照值相比+/-50%的变化所需的芯片数量。


结论

1.终点基线水平的变异性以及对毒性药物的敏感性可能会使结果的合并和解释变得困难:

Ø 批次1 显示低APAP时白蛋白减少,如果合并数据则会被忽略。

Ø 批次1 是否对APAP更敏感?合并批次是否会导致对敏感群体的潜在影响?


2.某些测定在不同批次间的一致性更高。

Ø ALT 在各批次之间的可靠性较高,而LDH似乎在某些批次中表现良好,但在其他批次中表现不佳。

Ø 尿素相对于白蛋白,对于细胞功能来说是一个不太敏感的标志物。


3.变异性、灵敏度、特异性和功效分析似乎都是由个体供体细胞特性(附着能力、对有毒成分的反应、基线生物标志物水平)的结果而变化的。


4.目前尚不清楚为什么有些批次/供体表现比其他批次/供体好或差,但在设计MPS系统中的毒性研究时,应考虑年龄、性别、种族和生活暴露等因素,以代表人口的大部分。需要进一步研究,以探讨个体供体、平均个体或混合供体是否更准确地预测大规模人群的毒性。


【推荐阅读】

CN-Bio器官芯片应用 —— 遗传毒性测试(可点击文字查看)


主要参考文献

Kostrzewski T, Cornforth T, Snow S. et al. Three-dimensional perfused human in vitro model of non-alcoholic fatty liver disease. World J Gastroenterol. Jan 2017.