发布时间：2023/03/27 点击数：简介
细胞治疗的最终治疗制剂发挥的效率和功效以及制造过程都直接受到低温冻的影响，因此深入了解低温冻存对细胞的影响对于细胞疗法的成功商业化生产至关重要。在本研究中研究者研究了一些工艺参数(CPPs)对人pan CD3+ T细胞解冻后存活率、活化后扩增和细胞因子分泌的影响，以评估这些参数在低温保存过程中的重要性。
本次研究的CPPs参数包括冻存液配方、DMSO含量、解冻后（稀释/洗涤前）稳定性和激活时间轴，主要是通过膜完整性、增殖率和激活后的INFy分泌来评估活性以表征细胞及冻存过程。
01- 实验步骤和方法
· 细胞培养
从HemaCare购买人pan CD3+ T细胞解冻将细胞种在6孔板中，解冻1小时后，使用抗CD3 /CD28/CD2 t细胞激活剂激活细胞，并将细胞培养板放置在37°C和5% CO2的培养箱培养10天后，从培养箱中取出培养皿收集细胞进行配方和低温保存。
· 冻存液选择
四种不同的冻存液，CryoStor CS5, CryoStor CS10和2种常见的实验室自制冻存液。用于冻存T细胞。两种自制配方分别含有Normosol-R或PlasmaLyte（PLA）以及相同的组分5% w/v重组人血清白蛋白和10% v/v DMSO (BloodStor 100, BioLife Solutions)。
· 低温冻存
从培养箱取出含有细胞的培养基，收集在15 mL离心管中。在冷冻前取出每组样品以评估计数和活力。T细胞球团成球后在冻存液中重悬。以1ml体积分布在2ml 冻存管中，细胞在2-8C下孵育15分钟。然后将冻存管移到程序降温仪中以-1°C/min的速度冷却，在10°C手动成核。在达到-70°C后，将冻存管转移到LN2存储至少24小时。
· 解冻与评估
样品在37°C水浴中解冻，然后在预热XF T细胞培养基中1:10重悬。解冻后立即收集样品进行活力和计数测量。每个细胞组被种在常规6孔板的2个孔中，一个孔静息对照，一个孔用于评估活化。解冻后加入抗CD3 /CD28/CD2活化试剂进行活化。此时将6孔板转移到37℃和5% CO2的培养箱中进行以下系列研究：
1- 研究活化前休息的影响，一组T细胞样品在CryoStor CS5中冷冻保存，在解冻后的培养中休息24 h后活化。
2- 研究DMSO浓度的影响，比较了在CryoStor CS5和CryoStor CS10中即分别用5%和10% v/v DMSO冷冻保存的两组T细胞样品。
3- 研究解冻后细胞处理前的细胞静息期的必要性，一组样品在解冻后立即在室温条件下放置1小时，然后再进行进一步处理。
对于所有样品，在解冻后的24小时和72小时，从每个孔中取出一小块来评估活力、计数（ChemoMetec NC-3000）和检测INFy分泌（ELISA）。
图1- T细胞冻存研究步骤和流程
02- 实验结果
图2- T细胞冻存实验结果汇总
1、即用型市售CS10与自制配方的冻存液影响研究
在DMSO含量相似的10% v/v的3个不同组中，CS10组的活力恢复得比其他两种自制冻存液快，接近未冷冻T细胞对照组。
而T细胞被激活后在所有组中观察到T细胞的活力下降，解冻后72 h CS10组的细胞活力最接近未冷冻对照组，统计学上也高于其他两种自制冻存液组。
总体而言，使用10% DMSO的3组冻存液的对比可以观察到他们解冻后和活化后的活力差异极小。然而在解冻后72 h，三组之间的扩增和INFy分泌有显著差异。在CryoStor CS10中冷冻保存的细胞在72小时内数量增加到与未冷冻对照相同的水平，显著高于其他两组在Normosol/HSA和PLA/HSA冻存液中冷冻保存的细胞数量。INFy对比也是类似情况：CS10组的分泌水平明显高于其他组，仅略低于未冷冻对照组。
2、DMSO浓度影响研究
通过比较CryoStor CS5和CS10配方（分别为5%和10%v/v DMSO）的效果，研究冻存液配方中DMSO浓度的增加对于细胞冻存的影响。
从图2可以看出CS10组解冻后72 h的活力低于活化后的CS5组，但CS10组细胞的扩张率明显高于CS5组，INFy的分泌量也明显高于CS5组。此外必须提到的是就细胞活力和扩增潜力而言，在较低DMSO浓度(5% v/v的CryoStor CS5)下冷冻保存的细胞的性能与使用10% v/v DMSO的实验室自制冻存液的性能相当。与含有10% v/v DMSO的PLA自制配方相比，CS5冷冻保存的细胞分泌更多的INFy。
3、解冻后细胞处理前的细胞静息期的必要性研究
在T细胞解冻后活化的3种不同场景的比较:(1)解冻后立即处理和活化，(2)解冻后等待(1小时)再进行进一步处理，(3)处理后24小时活化并静置培养。从图上可以看到活化导致在细胞解冻后短时间内丧失活力。因此据推测在激活之前确保解冻后有一个细胞静息期(在本例中为24小时)可能有利于减少细胞损失和增加扩增速率。
但是在细胞治疗制造和实践中，解冻后的稳定性是一个风险/关注点，建议在清洗或患者用药前提前了解细胞在解冻后保持稳定的时间。本研究结果表明，与解冻后立即处理的样品相比，在室温(20-25°C)解冻后等待1小时，对细胞的扩增能力以及INFy分泌有显著影响，有趣的是1小时等待组的细胞活力在统计学上保持不变，因此仅凭活力不足以评估这些工艺参数对T细胞质量的影响。此外观察到解冻后和激活前在培养液中静置24小时不一定能减少激活后细胞活力的损失(图2)。
03- 结论
与传统的实验室自制冻存液相比，CryoStor是一种更可靠的人CD3+ T细胞冷冻保存配方，即人CD3+ T细胞冷冻保存在无血清、无蛋白的CryoStor CS10冻存液与其他两种测试配方即Normosol-R + 5% w/v rHSA + 10% v/v DMSO和plasmalyte - a + 5% w/v rHSA + 10% v/v DMSO相比，在解冻后显示出增强或至少等效的质量和功能。
此外，在较低DMSO浓度(5% v/v)下冷冻保存的细胞的性能与使用10% v/v DMSO的实验室自制冻存液的性能相当，这表明通过使用如CryoStor的冻存液配方是一种降低最终产品中的DMSO含量的潜在方法。
对比CryoStor两种冻存液产品，较高浓度的DMSO (10% v/v)似乎比较低浓度的DMSO (5% v/v)更有效地保存人类T细胞。
在解冻后时间相同的情况下，静息培养的扩增率和INFy分泌明显低于细胞立即激活组的情况，这表明为了优化制造时间解冻后立即激活T细胞可能更有益。
本次研究结果表明美国BioLife Solutions品牌为细胞治疗提供优化的冻存液配方的生物保存方案，文中提供的无血清、无单报的CryoStor 系列冻存液主要含有下列几种产品：
CryoStor冻存液系列
CryoStor系列冻存液产品清单
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